הערכת הפוטנציאל האנטי-מיקרוביאלי של חיידקי צואה מורין מייצרי חיידקים מבודדים

תקציר

מקור: Bäuerl, C., et al. שיטה להערכת השפעות בקטריוצין על מיקרוביוטת המעי של עכברים. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים זיהוי של חיידקי חומצה לקטית מייצרי בקטריוצין שמקורם בחומר צואתי של עכברים. הבדיקה קובעת את הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של בקטריוצין על זני חיידקים ספציפיים.

פרוטוקול

1. ספירת מעבדה ופעילות בקטריוצין

1. שקול גלולת צואה אחת מכל דגימה בצינור של 1.5 מ"ל והוסף נפח מספיק של 0.9% NaCl קר כקרח כדי להשיג תמיסה של 10% (w/v). השתמש מיקרו pestles סטרילי עבור צינורות 1.5 מ"ל כדי הומוגניזציה של תרחיף צואה ולהכין דילולים סדרתיים פי עשרה קר כקרח 0.9% NaCl.
2. ספירת המספר הכולל של תאי LAB.
   1. מעבירים תאים מדוללים (100 μL) ל-4 מ"ל של אגר רך Man Rogosa Sharpe (MRS) שחומם מראש (50°C, 0.8% אגר). מערבבים על ידי ערבול לפני שיוצקים את התאים על צלחת אגר MRS מוצקה (1.5% אגר).
   2. יבש את הצלחת על ידי הסרת המכסה במשך 5 - 10 דקות במכסה המנוע הסטרילי לפני הדגירה על התאים במשך 20 - 24 שעות ב 30 ° C לצמיחת תאים והיווצרות מושבה.
3. לספור תאים מייצרי בקטריוצין.
   1. מעבירים תאים מדוללים (100 מיקרוליטר) של יצרן הבקטריוצין ל-4 מ"ל של אגר רך MRS שחומם מראש (50°C, 0.8% אגר), מערבבים על ידי מערבולות ויוצקים את התאים על צלחת אגר MRS (1.5% אגר); שכבה זו מכונה השכבה הראשונה.
   2. העבר עוד 4 מ"ל של אגר רך MRS ללא תאים (0.8% אגר) לשכבה הראשונה כדי להטמיע את כל התאים בתוך האגר הרך.
      הערה: שכבה זו נועדה למנוע תאים מלגדול כמושבות על פני לוחות האגר. תאים הגדלים על פני השטח נעקרים בקלות כאשר שופכים תאי מחוון על החלק העליון (שלב 4.3.4) ולכן יסבכו את פרשנות התוצאות. שכבה זו מכונה השכבה השנייה.
   3. יבש את הצלחת על ידי הסרת המכסה במשך 5 - 10 דקות במכסה המנוע הסטרילי לפני הדגירה במשך 20 - 24 שעות ב 30 ° C לצמיחת תאים והיווצרות מושבה.
   4. כדי לזהות מושבות המייצרות חיידקים, ערבבו 40 מיקרוליטר של תרבית לילה של זן אינדיקטור מתאים, עם 4 מ"ל של אגר רך שחומם מראש. יוצקים את התערובת על הצלחת; שכבה זו מכונה השכבה השלישית.
   5. יבש את הצלחת על ידי הסרת המכסה במשך 5 - 10 דקות במכסה המנוע הסטרילי לפני הדגירה במשך 20 - 24 שעות ב 30 ° C לצמיחת תאים והיווצרות מושבה.
      הערה: למושבות המייצרות בקטריוצין יש אזורים ברורים (עיכוב) סביב המושבות (איור 1).

תוצאות

איור 1: זיהוי ייצור בקטריוצין ב-LAB שהוחזר מצואה על-ידי פרוטוקול תלת-שכבתי (כמתואר בהליך)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת פטרי מפלסטיק	תרמו סיינטיפיק	101VR20
מרק עירוי מוח-לב	קונדה	1400
אגר בקטריולוגי אירופאי	פרונדיסה	1800
Agarose D1 EEO נמוך	פרונדיסה	8010
1x מאגר TAE	תרמו סיינטיפיק	15558042
מרק גברת	דיפקו	288130
טבליות PBS	סיגמא	P4417-100TAB
סולם	מטלר טולדו	PB602-S