1. ציפוי BMM על כיסויים לזיהום
- הכינו לוחות תרבית רקמה של 6 בארות על ידי הנחת ארבעה (4) כיסויי זכוכית סטריליים בקוטר 12 מ"מ (אוטומטיים ומאוחסנים במיכל זכוכית סגור) בתחתית כל באר ריקה.
הערה: בחרו כל כיסוי סטרילי בקוטר 12 מ"מ עם קצה שואף המותאם לקו ואקום. מניחים את הכיסויים לתוך הבארות ללא חפיפה, ומשחררים אותם במיקום הרצוי על ידי צביטת הצינור כדי להפריע לוואקום.
- יש לשאוף מדיה (וכל התאים שאינם דבקים) מצלחות פטרי מצופות במקרופאגים דבקים שמקורם במח עצם ולשטוף בעדינות תאים דבקים 2x במי מלח חוצצים פוספט סטרילי של דולבקו ללא סידן ומגנזיום כלורי (PBS -/-) שחומם מראש ל-37°C.
- הוסף טיפתית, 5 מ"ל סטרילי 1x PBS -/- עם ריכוז סופי של 1 mM EDTA לכל צלחת פטרי ודגר במשך 5 דקות ב 37 ° C כדי לנתק BMM דבק. ודא כי התאים מנותקים באמצעות מיקרוסקופ.
- לאסוף את כל התאים מנותקים מרחפים 1x PBS -/- בתוספת 1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) בצינור חרוטי 50 מ"ל. יש לשטוף כל צלחת 2x עם 5 מ"ל PBS -/- ולהוסיף לבריכת תרחיף התא.
הערה: ניתן לדלל את תרחיף התאים עם PBS נוסף -/- כדי להגן על מקרופאגים מפני רעילות EDTA במהלך תהליך האיסוף.
- צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant ו resuspend מקרופאגים ב 5 - 10 מ"ל BMM בינוני על ידי pipetting. הניחו תאים מרחפים על קרח כדי למנוע היצמדות לצינורות והצטברות.
- ספירת תאים קיימא באמצעות הדרה כחולה טריפאן בהמוציטומטר.
הערה: כדי לספור תאי BMM מרחפים מחדש בתווך 5 מ"ל, תערובת דילול של 25 μL תרחיף תאים ב 445 μL PBS -/- ו 30 μL 0.4% תמיסה כחולה טריפאן בדרך כלל מאפשרת כימות קל בהמוציטומטר (תוך התחשבות במקדם דילול פי 20 לחישוב הסופי). ספרו רק תאים שלא הוכתמו בכחול טריפאן (תאים ברי קיימא). נפח תרחיף התאים עשוי להשתנות אם תערובת זו מרוכזת או מדוללת מדי. באופן כללי, התשואה של BMM לכל הכנה משתנה בין 2 x 107 ו 5 x 107 תאים מעכבר יחיד.
- מכינים את תרחיף התא בתווך BMM בריכוז הציפוי הרצוי (5 x 105/mL) ומפזרים את התרחיף ל 6 לוחות באר ב 2 מ"ל בינוני לכל באר כך שכל באר מקבלת 1 x 106 מקרופאגים.
הערה: זהו צעד קריטי שמבטיח שכל באר תקבל את המספר המתאים של מקרופאגים כדי לכסות את הכיסויים באופן אחיד. בדקו שהכיסויים בבארות אינם חופפים או צפים בתווך. אם כן, יש לכוונן בעדינות עם קצה פיפטה סטרילי.
- יש לדגור למשך הלילה ב-37°C, 5% CO2.
2. טיהור צורות זיהומיות של L. amazonensis
הערה: הכינו לישמניה לזיהומים - טהרו פרומסטיגוטים מטאציקליים מתרביות פרומסטיגוט נייחות או הבדילו פרומסטיגוטים בתרבית לצורת אמסטיגוט באמצעות פרוטוקול התמיינות אקסני סטנדרטי של L. amazonensis.
- טיהור פרומסטיגוטים מטאציקליים של לישמניה באמצעות מדדי שיפוע צפיפות (חומרים)
- הכינו תמיסת מלאי של 40% משטח שיפוע צפיפות במים סטריליים נטולי אנדוטוקסינים.
- יש לדלל את תמיסת שיפוע הצפיפות בתווך M199 10x (ללא סרום) כדי להכין ריכוז של 10% בתווך M199.
- סנן את כל הפתרונות דרך 0.22 מיקרומטר filter.
הערה: פתרונות מלאי ניתן לאחסן ב 4 ° C בחושך לא יותר מ 1 חודש.
- הוסף 2 מ"ל של תמיסת מדיה הדרגתית בצפיפות 40% בתחתית צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל.
- שכבה 2 מ"ל של תמיסת מדיה עם שיפוע בצפיפות של 10% ב-M199 על גבי שכבת המדיה של מעבר הצבע בצפיפות של 40% בזהירות, תוך שימוש בפיפטת פסטר כדי למנוע ערבוב בין שתי השכבות.
- לאסוף 1 x 109 טפילים מתרבית בשלב נייח על ידי צנטריפוגה ב 1,900 x גרם במשך 10 דקות.
- תאי השהיה מחדש ב- 6 מ"ל מדיום חיוני מעובד של Dulbecco (DMEM).
- שכבה 2 מ"ל של תרחיף התא ישירות על גבי שכבת המדיה בעלת שיפוע הצפיפות של 10%, בעדינות, באמצעות פיפטת פסטר כדי למנוע ערבוב בין השכבות.
- צנטריפוגה את השיפוע למשך 10 דקות ב 1,300 x גרם בטמפרטורת החדר.
הערה: בשל הבדלים בתכונות הפיזיות בין מיני הלישמניה, ייתכן שיהיה צורך להתאים מעט את תנאי הצנטריפוגה עבור כל אחד מהם כדי להבטיח תפוקה מרבית.
- אספו טפילים (מועשרים בצורת פרומסטיגוט מטאציקלית) מהרצועה שנוצרה בגבול המדיה העליונה של שיפוע הצפיפות של 10% (ממשק בין שכבות המדיה של שיפוע הצפיפות 0% ו-10%).
- לדלל טפילים עם נפח אחד של DMEM ולאסוף על ידי צנטריפוגה (1,900 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר).
- השהה מחדש בתווך DMEM של 500 μL וספור בהמוציטומטר כדי לכמת את התשואה.
- יצירת L. amazonensis amastigotes בתנאי תרבית אקסנית (pH נמוך / טמפרטורה גבוהה).
- מערבבים 5 מ"ל של תרבית פרומסטיגוט שלב לוג (pH 7.4 ב 26 oC) עם נפח שווה של מדיום אמסטיגוט (pH 4.5), באמצעות 25 ס"מ2 צלוחיות (סה"כ 10 מ"ל בינוני) ולדגור ב 26 ° C במשך הלילה.
- העבר את הבקבוק מ 26 °C ל 32 °C (75 °F).
- לאחר 3 או 4 ימים, לפצל תרבית 1: 5 במדיה amastigote ב 32 ° C.
- בדוק את הטפילים ב 3 - 4 ימים הבאים (מקסימום 7 ימים) כדי לראות אם הם מוכנים לשימוש זיהומים.
הערה: אמסטיגוטות אקסניות בריאות צריכות להיות בעלות צורה אליפטית, ללא שוטונים גלויים. לאמסטיגוטים מובחנים חלקית יש צורה אליפסה גדולה עם שוטונים קצרים. התרבות לא צריכה להיות הרבה גושים - גושים רבים הם אינדיקציה של טפילים שאינם גדלים, גוססים. ניתן לפצל את תרבית האמסטיגוט ביחס של 1:5 ולשמור עליה למשך 3 שבועות לכל היותר.
3. זיהום עם L. amazonensis
- תרחיף טפיל מדולל בהתאם ל-MOI הרצוי (בדרך כלל 3-5 פרומסטיגוטים מטאציקליים למקרופאג [MOI של 1:3 או 1:5] ו-1 אמסטיגוט למקרופאג [MOI 1:1]). הוסף לישמניה ב- PBS -/- בנפח של 50 - 100 μL לכל באר שכבר מכילה 2 מ"ל בינוני.
- לדגור BMM במשך 1 שעה עם amastigotes ו 3 שעות עם promastigotes metacyclic ב 34 oC עבור זיהום.
הערה: טמפרטורת זיהום אופטימלית עשויה להשתנות בהתאם למין.
- לאחר הדגירה, יש לשטוף היטב טפילים חופשיים בכל באר 3x עם 2 מ"ל PBS -/- שחומם מראש ל 37 ° C.
הערה: פזרו PBS בעדינות כדי להבטיח שהכיסויים לא יצופו זה על זה. מערבלים בעדינות את הצלחת ואז שואפים החוצה את הנוזל. השתמש בטיפים נפרדים אם אתה משתמש בזנים מרובים של טפילים כדי למנוע זיהום צולב.
- תקן דגימות נקודת זמן של שעה או 3 שעות על ידי דגירה של כל באר עם 1.5 - 2 מ"ל של 2% PFA ב- PBS -/- למשך 10 דקות. שטוף 3x עם PBS -/-. אין לשאוף לשטיפה אחרונה ולשמור במקרר צלחות המכילות כיסויים ב-PBS עד להכתמה.
- הוסף 2 מ"ל מדיום BMM טרי לכל באר על צלחות לנקודות זמן נוספות ודגור ב 34 ° C.
- תקן את נקודות הזמן הנותרות כמתואר בשלב 4.3, ושמור את הצלחות בקירור עד להכתמה.
4. צביעת DAPI והרכבה סמויה
- שאפו PBS מבארות המכילות כיסויים והוסיפו 1.5 מ"ל PBS -/- עם 0.1% חומר ניקוי לא יוני. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף 3x עם PBS 2 מ"ל -/-.
- הוסף 1 מ"ל PBS -/- עם 2 מיקרוגרם / מ"ל 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (מדולל מ 5 מ"ג / מ"ל תמיסת מלאי במים) לבארות המכילות כיסויים ולדגור עוד 1 שעה בטמפרטורת החדר.
הערה: זמן הדגירה עם DAPI הוא קריטי להדמיה נכונה של טפילי לישמניה תוך תאיים. גרעיני המקרופאגים מכתימים במהירות, בשל גודלם הגדול יותר ותכולת הדנ"א שלהם, אך צביעת גרעיני הטפילים התוך-תאיים איטית יותר. לפיכך, הארכת זמן הדגירה מעבר למה שנדרש כדי לדמיין את גרעיני ה-BMM נחוצה כדי לאפשר ל-DAPI לחלחל דרך קרום הפלזמה של הטפיל וקרום הגרעין של הטפיל. עם כתם DAPI תקין, ניתן גם לדמיין את הדנ"א הקינטופלסטי המיטוכונדריאלי ליד כיס השוטון של הטפיל, בנוסף לדנ"א הגרעיני.
- יש לשטוף כל באר המכילה כיסויים 3x עם PBS של 2 מ"ל -/- ולאחר מכן להרים ולהעיף כיסויים עם מלקחיים כדי להניח את צד התא כלפי מטה ולהרכיב על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עם מגיב הרכבה נגד דהייה זמין מסחרית.
הערה: כיסויים הם שבירים ביותר ודורשים טיפול זהיר. הימנע מהפעלת לחץ עליהם, במיוחד על דופן הבארות בעת הרמה. הוספת כמה טיפות של PBS -/- מפחיתה את מתח הפנים בין הכיסוי לבאר ומקלה על תהליך ההרמה. ניתן להשתמש במחט מדידה עדינה כדי לסייע בחטטנות בכיסויים מתחתית הבאר. לאחר הנחת מכסה על המגלשה, לחץ בעדינות כלפי מטה עם מלקחיים כדי לדחוף החוצה בועות אוויר באמצעי ההרכבה. אם החלקה נשברה או התהפכה במהלך תהליך ההרמה, אין להרכיב מחדש; פשוט השתמש בכיסוי הרביעי הרזרבי.
- מקררים שקופיות עד לכימות.
5. כימות זיהום
- בחן שקופיות מוכתמות ב-DAPI תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי על ידי התמקדות במקרופאגים באמצעות עדשה אובייקטיבית 100X עם שמן טבילה (עירור ב-358 ננומטר; פליטה אופטימלית ב-461 ננומטר).
ודא שהמיקוד הוא על שכבת המקרופאגים בין מגלשת הזכוכית לכיסוי.
- כמת את מספר המקרופאגים (גרעינים גדולים המוכתמים ב-DAPI) ואת מספר גרעיני האמסטיגוט הקטנים יותר המקובצים סביב כל גרעין מקרופאג (ראו איור 1A, DAPI) עבור כל שדה ראייה, באמצעות מונה ידני.
הערה: גרעיני אמסטיגוט עשויים שלא להיראות כולם במישור מיקוד אחד בשל גודלם הקטן. ספרו את אלה הנראים לעין כאשר התמקדו בגרעיני המקרופאגים, ולאחר מכן השתמשו במיקוד עדין כדי לבדוק אם קיימים גרעיני טפילים במישורים שמעל ומתחת לגרעיני המקרופאגים.
- עברו לשדה ראייה אחר כדי לחזור על הכימות. השתמש במפתח מונה נפרד כדי לעקוב אחר מספר השדות שנספרו. עבור בין שדות חזותיים בשורות מקבילות לאורך כל תלוש כיסוי, כדי למנוע חפיפה בין הספירה.
- כמת מינימום של 200 מקרופאגים לכל כיסוי. לכמת כל נקודת זמן של זיהום במשולש (3 כיסויים). ספור את תלוש הכיסוי הרביעי אם אחד הקודמים אינו מתאים לספירה עקב חפיפת כיסוי, הרכבה לקויה, שבירת זכוכית וכו '< / >
הערה: אם לא ניתן לספור 200 מקרופאגים על מכסה אחד, ספרו את הרביעי הרזרבי.
- חשב את שיעורי ההדבקה כאמסטיגוטים/מקרופאגים או אמסטיגוטים/100 מקרופאגים וקבע את אחוז המקרופאגים הנגועים מנתוני הכימות הגולמיים.
