$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת חיידקים
הערה: מצעים חיידקיים של תאים שלמים ופפטידוגליקנים מטוהרים משמשים כמצעי אנזימים הן בבדיקת הדיפוזיה של המיקרו-גלישה והן בבדיקת שחרור הצבע. מצעים אלה דורשים הכנה לפני ביצוע תגובות האנזים. הפרוטוקול הבא מתאר את הכנתם.
- מצע תא חיידקי שלם
- לייצר מצע תא חיידקי על ידי חיסון 500 מ"ל של מרק מזין עם 2 מ"ל תרבית לילה של Bacillus subtilis 168 (אוסף תרביות סוג אמריקאי; ATCC 23857). דוגרים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם טלטול (125 סל"ד) עד שהתרבית מגיעה לשלב אקספוננציאלי של גדילה, המוגדר כשלב גדילה מהיר המביא להכפלת תרבית החיידקים. לטיפוח Salmonella enterica subsp. enterica (ATCC 10708), השתמש במרק מזין כמדיום צמיחה ב 37 ° C עם רעד (125 סל"ד).
- הרוג בחום כל תרבית על ידי autoclaving במשך 10 דקות ב 121 ° C תחת 3 אטמוספירה של לחץ.
- קצרו את מצע החיידקים שהומתו בחום על ידי צנטריפוגה למשך 20 דקות במהירות של 5,000 x גרם. שטפו את הגלולה שלוש פעמים במים מסוג 1 והשהו מחדש בכמות מינימלית של מים. במחקר זה, להשהות את המצע ב 1,200 μl.
- Aliquot 300 μl של מצעי התא החיידקי לצינורות מיקרופוגה 1.5 מ"ל ולאחסן ב 20 ° C.
2. תיוג מצעים - Remazol Brilliant Blue R תיוג צבע
הערה: בבדיקת שחרור הצבע, המצע מקושר באופן קוולנטי לצבע R כחול מבריק של Remazol. הפרוטוקול הבא מתאר את הכנת סובסטרטים של אנזימים צבועים.
- הכינו תמיסת נתרן הידרוקסידי (NaOH) של 250 מ"מ על ידי המסת 1 גרם NaOH ב-99 מ"ל מים מסוג I שישמשו להכנת תמיסת צבע R כחול מבריק (RBB) של Remazol בנפח 200 mM.
- צור תמיסת RBB של 200 מ"מ על ידי המסת 1.25 גרם RBB ב- 98.75 מ"ל ± 1 מ"ל של תמיסת NaOH טרייה של 250 mM.
- יש להשהות מחדש תאי חיידקים שנהרגו בחום בריכוז של 0.5 גרם משקל רטוב ב-30 מ"ל של תמיסת RBB. עבור פפטידוגליקן מטוהר, להשעות מחדש את הפפטידוגליקן בריכוז של 0.3 גרם משקל רטוב ב 30 מ"ל של תמיסת RBB.
- יש לדגור על תערובת התגובה בבקבוק Erlenmeyer על מצע מסתובב למשך 6 שעות בטמפרטורה של 37°C בערבוב עדין.
- מעבירים את תערובת התגובה לאינקובטור בטמפרטורה של 4°C ודגרים למשך 12 שעות נוספות בערבוב עדין.
- לאחר הדגירה, קוצרים את המצע הצבוע באמצעות צנטריפוגה בגודל 3,000 x גרם למשך 30 דקות. מרוקנים את תמיסת הצבע מכדורית המצע.
- הסר צבע מסיס שאינו קשור קוולנטית מהמצע על ידי שטיפת התאים המסומנים בצבע או פפטידוגליקן שוב ושוב (כ 3-5 כביסות) עם מים מסוג I ולאחר מכן צנטריפוגה. עם כל תוספת מים, להשהות מחדש את הגלולה ביסודיות.
הערה: כאשר הצבע המסיס אינו קשור, הוא כבר לא נראה בשטיפת המים לאחר הצנטריפוגה. יש לתת למצע שטיפה אחת נוספת. שימו לב שהמצע יישאר כחול, ואילו הסופרנאטנט של הכביסה האחרונה יהיה שקוף.
- אחסנו את המצעים הצבועים מרחפים בכמות מינימלית של מים בטמפרטורה של -20°C לשימוש מאוחר יותר.
3. בדיקת שחרור צבע כמותית
הערה: במהלך בדיקת שחרור הצבע, ההידרוליזה של מצע צבוע RBB בתגובה האנזימטית משחררת תוצרים צבועים לתוך סופרנטנט התגובה. מדידה קולורימטרית של כמות הצבע המשתחררת מציינת את כמות הפעילות האנזימטית הקיימת בדגימה עבור אנזים נתון. השיטה הכמותית מאפשרת השוואה בין אנזימים שונים על פני מצעים שונים ומאפשרת שונות של תנאי הסביבה המשפיעים על התגובה האנזימטית (למשל, טמפרטורה, מליחות ו-pH). הפרוטוקול הבא מתאר את ההכנה והביצועים של בדיקת שחרור הצבע לזיהוי כמותי של הפעילות האנזימטית של חלבונים אנטי-מיקרוביאליים.
- הכנה לבדיקת שחרור הצבע
- יש לאפשר למצע הצבוע הקפוא לחזור לטמפרטורת החדר ולשטוף פעמיים עם חיץ בדיקה (מלח חוצץ פוספט, PBS), אשר נקבע אמפירית עבור האנזים הנתון.
- חשב את נפח מתלה המצע הדרוש על ידי הכפלת נפח התגובה של 200 μl במספר מבחני שחרור הצבע שיש לבצע.
- הכן את מתלה המצע על ידי הוספת מצע צבוע לנפח מאגר הבדיקה, שנקבע ב- 4.1.2, עד להשגת צפיפות אופטית (OD) של 2.0 ב- 595 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. כדי להישאר במסגרת המגבלות הפונקציונליות של הספקטרופוטומטר, מדוד את OD595 2.0 כ- 1.0 לדילול 1:1 של התמיסה המרוכזת. השתמש במאגר assay כמאגר ריק.
הערה: ניתן להעלות את עכירות המצע של התגובה מעבר ל-2.0 כדי להתאים לרמות הפעילות של אנזימים יעילים במיוחד.
- יש להשהות את החלבון האנטי-מיקרוביאלי כדי לעבור הערכה במאגר הבדיקה בריכוז משוער של 1 מ"ג/מ"ל.
- באמצעות בדיקת microplate של חומצה Bicinchoninic (BCA) חלבון Assay Kit על פי פרוטוקול היצרן, לקבוע את הריכוז בפועל של דגימת החלבון להיבדק. התאם את ריכוז תרחיף המלאי ל- 1 מ"ג/מ"ל באמצעות מאגר בדיקה.
- שימוש בבדיקת שחרור צבע כדי לקבוע את תנאי הדגירה האופטימליים עבור חלבון אנטי-מיקרוביאלי
- דללו את התרחיף האנטי-מיקרוביאלי של חלבון הציר ל-100 ננוגרם/מיקרוליטר. ריכוז זה נותן מסת תגובה סופית של 1 מיקרוגרם חלבון לכל נפח (10 μl) שנוסף לתגובת הבדיקה.
- לקבוע את טווח תרמי להיות מוערך עבור חלבון bacteriolytic. הטווח התרמי בבדיקות אלה כלל 5 °C (75 °F), 15 °C (75 °F), 25 °C (75 °F), 35 °C (75 °F), 55 °C (75 °F) ו-65 °C (75 °F).
- בצע את בדיקות התגובה בצינורות מיקרופוגה של 0.5 מ"ל. עבור כל מצב תרמי, להוסיף 10 μl של חלבון ציר ל 200 μl של תרחיף מצע מוכן.
- דוגרים במחזור תרמי במשך 8 שעות עם ערבוב על ידי היפוך פעם בשעה.
- לאחר הדגירה, לעצור את התגובות על ידי הוספת 25 μl של אתנול.
- הסר מצע לא מעוכל ובלתי מסיס באמצעות צנטריפוגה ב 3,000 x גרם למשך 2 דקות, והעבר 150 μl של סופרנאטנט התגובה עבור כל תערובת תגובה למיקרו-צלחת בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות, תוך זהירות שלא לשבש את כדורית המצע הלא מעוכל.
- למדוד את הפעילות האנזימטית של החלבון האנטי-מיקרוביאלי עבור המצע הנתון על ידי קביעת כמות צבע RBB מסיס מנותק מהמצע לאחר הידרוליזה אנזימטית. כדי לכמת את הפעילות האנזימטית, מדדו את ספיגת הסופרנאטנט ב-595 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-פלטות. ספיגה מוגברת על ידי הצבע המסיס המשתחרר לסופרנאטנט מהמצע המסומן היא מדידה כמותית של פעילות אנזימטית.
הערה: השינוי בספיגה מיוצג על ידי יחידות פעילות (AU), כאשר 1 AU מביא לעלייה של 0.01 בצפיפות האופטית של סופרנאטנט תגובת שחרור הצבע ב 595 ננומטר. תגובה ריקה, מודגרת עם כל רכיבי התגובה למעט האנזים, משמשת להחסיר כל צבע שמשתחרר מהמצע המסומן בתווית RBB עקב הדגירה. הטמפרטורה האנזימטית האופטימלית מספקת את מדידת יחידת שיא הפעילות.