אימונוהיסטוכימיה: מדורים פרפין שימוש ABC Vectastain קיט מ וקטור Labs

תקציר

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה יקר מנוצל כדי למקם / לדמיין ביטוי חלבון בסעיף רקמה רכוב באמצעות נוגדנים ספציפיים. קיימות שתי שיטות: השיטה הישירה והעקיפה. בניסוי זה, נוכל רק לתאר את השימוש מכתים IHC עקיף. העקיפים מכתים IHC מנצל מאוד ספציפיות נוגדנים משני הראשי ביוטין, מצומדות. נוגדנים ראשי מנוצלים discretely לזהות חלבונים עניין באמצעות קשירה epitope מסוים, ואילו נוגדנים משני לחסר עבור מכתים הלא ספציפית רקע להגביר את האות על ידי יצירת קומפלקסים כדי נוגדן הראשוני. שקופיות יכול להיות שנוצר חלקים קפואים, או חלקים פרפין מוטבע רכוב על שקופיות הזכוכית. בפרוטוקול זה, אנו דנים על הכנת פרפין משובצים קטעים ידי הידרציה dewaxing, באמצעות שיפוע אלכוהול, אחזור המושרה חום אנטיגן, וחסימת פעילות peroxidase אנדוגני ולא אתרי קישור ספציפיים. סעיפים חלקם מוכתמים אז עם נוגדנים ספציפיים עבור סמן תא T CD8 ו בעוד אחרים הם מוכתם עבור hydroxylase טירוזין. מגלשות מטופלים לאחר מכן עם נוגדנים משני המתאים מצומדות כדי ביוטין, שפותחה לאחר מכן ניצול avidin-מצומדות peroxidase חזרת (HRP) עם Diaminiobenzidine (DAB), כמו המצע. בעקבות פיתוח, מגלשות הם counterstained עבור לעומת זאת, ועלה תחת coverslips עם permount. לאחר ייבוש נאותה, מגלשות אלה אז מוכן הדמיה.

פרוטוקול

מכתים סעיפים פרפין

1. Dewax שקופיות עם קסילן (פישר X3 ^S -4) 3x 5 דקות כל אחד (קסילן לשנות מדי חודש בהתאם לשימוש, קסילן הוא רעיל). השתמש מנות מכסה במשך 20 שקופיות פישר נ"צ 08-812-1A ו racks עשה כדי להתאים את הכלים האלה. 200 מ"ל נוזלים לכל מאכל.
2. מימה דרך שיפוע אלכוהול כדלקמן (שינוי הדרגתי כל 2 שבועות):
   • 2x באתנול 100% (פישר # A406-20) עבור כל 2 דקות
   • 2x באתנול 95% עבור כל 2 דקות
   • 1x באתנול 70% עבור 2 דקות
   • 1x באתנול 50% עבור 2 דקות
   • 1x באתנול 30% עבור 2 דקות
   • 1x DDH ₂ O 2 דקות
3. משרים DPBS דקות 5 (DPBS = פוספט שונה של Dulbecco בופר עם Ca ^{2 +} ו - Mg ^{2 +).}

Antigen התאוששות:

1. מחממים את מאגר Na-ציטראט (10 מ"מ, ה-pH 6.5) במיקרוגל.
2. מבשלים את השקופיות עבור 15 דקות במיקרוגל. השקופיות לא צריך לבדוק כל כך יבש דקות ולהוסיף Na-ציטראט בעת הצורך.
3. בואו מגניב בטמפרטורת החדר.
4. חסימת פעילות peroxidase אנדוגני עם 1% H ₂ O ₂ ב DPBS במשך 20 דקות (1.5 מ"ל של המניה 30% סיגמא H-1009 ב DPBS 50 מ"ל).
5. משרים 5 דקות DPBS 3 x.
6. בלוק הלא ספציפית באתרים דוגרים על ידי לילה ב 4 מעלות צלזיוס DPBS + 5% שור בסרום אלבומין (BSA) + 0.1% אזיד Na + 5% בסרום.
   
   הערה: בחירת נסיוב יהיה תלוי מין שבו נוגדנים המשמשים מכתים נעשו. בלוק עם סרום מן המינים שבו אב משני (מצומדות כדי ביוטין) התקבלה. אם זה אינו זמין, להשתמש בסרום של זן שונה מזה שבו Ab העיקרית נעשתה.
   
   
7. חסימת האתרים ביוטין עם avidin / ביוטין חסימת Kit (וקטור מעבדות קטלוג # SP-2001):
   • דגירה עם Avidin D במשך 15 דקות. לשטוף קצר עם DPBS.
   • דגירה עם פתרון ביוטין במשך 15 דקות.
8. מדגירים את Ab העיקרי 2 שעות בטמפרטורת החדר, ב DPBS + 2% + BSA NaAzide 0.1% + 2% בסרום (זהה עבור חסימת צעד).
9. משרים 5 דקות PBS 3 x.
10. דגירה עם Ab המשני מצומדות עם ביוטין שעה 1 בטמפרטורת החדר DPBS + 2% + 0.1% BSA Na אזיד + 2% בסרום (כמו משמש צעד חסימה).
11. הכן מגיב ABC באותו זמן כי יש לפתח דקות לפחות 30 לפני השימוש! (ראה חומרים)
12. הכינו צינור חרוטי 50 מ"ל. בשנת 15 DPBS מ"ל (ללא נסיוב, לא אזיד) להוסיף 3 טיפות של מגיב, לערבב ולהוסיף 3 טיפות של B מגיב ומערבבים. הימנע לסחוט את הבקבוקים, אלא לחכות טיפות כדי ליצור בכוחות עצמם. ABC ערכת Vectastain PK-6100 מ-Vector Labs.
13. משרים 5 דקות DPBS 3 x.
14. דגירה עם מגיב ABC עבור 30-45 דקות בטמפרטורת החדר.
15. משרים 5 דקות DPBS 3 x.
16. הכנת המצע DAB peroxidase (וקטור Labs # SK-4100) ב 5 מ"ל DDH ₂ O בבקבוקון זכוכית מיד לפני השימוש (ראה חומרים)
    • 2 טיפות של תמיסת למלאי, לערבב
    • 4 טיפות של DAB, לערבב (צריך להיות מעט חום)
    • 2 טיפות H ₂ O _2, לערבב
17. זרוק את המצע DAB על גבי שקופיות ולצפות עבור כתמים חומים.
18. טובלים שקופיות לקרח + ברז כדי לעצור את התגובה.
19. יש לשטוף תחת מי ברז קרים למשך 5 דקות.
20. Counterstain עם Hematoxylin (20 שניות; פישר CS401-D) ולשטוף במי ברז עד שהמים מגיע ברורה החוצה.
21. מייבשים דרך שיפוע אלכוהול החל אתנול 30% עד 100% אתנול (2 דק 'כל אחד).
22. משרים קסילן דקות 3 x 5.
23. הר עם Permount (פישר # SP15-100): לשים כמה לעיל בסעיף בשקופית ולחץ לאט על הקטע עם coverslip ללא בועות אוויר. אל תזיז את coverslip עד יבש לחלוטין, אשר לוקח ~ 24 שעות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קסילן	Fisher Scientific	X3S-4	יש להחליף את ה-xylene בכל חודש, בהתאם למידת השימוש. xylene הוא רעיל.
100% אתנול	Fisher Scientific	A406-20	השתמש להכנת מדרג אתנול (EtOH).
DPBS			דולבקו’סלקוציה של Phosphate Buffered Saline משופר עם Ca2+ ו-Mg2+
בופר Na-Citrate			10 mM, pH 6.5
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009	תמיסת מקור (stock) בריכוז 30% => דלל ל-1% ב-DPBS
תמיסת חסימה			DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% סרום.
BSA
נתרן אזיד			סודיום אזיד
ערכה לחסימת אווידין/ביוטין	Vector Laboratories	SP-2001
בופר נוגדנים (Ab buffer)			DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% סרום (בדומה לזה ששימש לשלב החסימה)
ערכה ABC Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
סובסטרט פרוקסידאז DAB	Vector Laboratories	SK-4100
מים מזוקקים כפולים (ddH2O)
המטוקסילין	Fisher Scientific	CS401-D	צביעה נגדית
סגירה (Permount)	Fisher Scientific	SP15-100
זכוכיות עצמים וזכוכיות כיסוי			זכוכית