בדיקת צלחת נקודתית להערכת תגובות עקה חמצונית בזני חיידקים

תקציר

מקור: Ketelboeter, L. M. et al., שיטות לעכב ייצור פיומלנין חיידקי ולקבוע את העלייה המתאימה ברגישות לעקה חמצונית. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים בדיקת לוחית נקודתית המותאמת להערכת תגובות העקה החמצונית של זני חיידקים. זנים מסוימים מייצרים פיומלנין, פיגמנט נוגד חמצון. לעומת זאת, זנים המטופלים בחומר בדיקה, המוביל לייצור מופחת של פיומלנין, מפגינים רגישות מוגברת לעקה חמצונית, וכתוצאה מכך כדאיות התא פוחתת בהשוואה לזנים מייצרי פיומלנין.

פרוטוקול

1. הכנת תרבית מדיה, אנטיביוטיקה ו-2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)

1. הכינו ציר לוריא-ברטאני (LB) (1% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים, 0.25% נתרן כלורי, NaCl ב-H₂O) והוסיפו אליציטוט לכמויות מתאימות. לעקר על ידי autoclave. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
2. הכינו אגר במשקל 100 מ"ל LB (1% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים, 0.25% NaCl, 1.5% אגר ב-H₂O) בצלוחיות של 250 מ"ל. לעקר על ידי autoclave ולאחסן בטמפרטורת החדר. יש לוודא שהאגר נמס לפני המזיגה לצלחות.
   הערה: צלוחיות המכילות 100 מ"ל אגר LB יניבו 4 צלחות. ניתן לשנות את כמות אגר LB כך שתתאים למספר הצלחות הדרושות לבדיקה.
3. הפוך מלוחים חוצצי פוספט, PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM אשלגן כלורי, KCl, 10 mM דיסודיום מימן פוספט, Na₂HPO₄, 2 mM אשלגן דימימן פוספט, KH₂PO₄). יש לעקר באמצעות אוטוקלאבה או סינון ולאחסן בטמפרטורת החדר.
4. הכינו את תמיסות מלאי האנטיביוטיקה לגנטמיצין, קנמיצין וטוברמיצין.
   1. הכינו מלאי אנטיביוטי מתאים לזני Pseudomonas aeruginosa המכילים 100 מ"ג/מ"ל גנטמיצין, 30 מ"ג/מ"ל קנמיצין ו-10 מ"ג/מ"ל טוברמיצין. יש להמיס את האנטיביוטיקה במים, לסנן, לעקר (0.2 מיקרומטר) ולאחסן בטמפרטורה של 4°C. לשנות את האנטיביוטיקה ואת הריכוזים בהתאם לחיידק שנחקר.

2. בדיקת צלחת נקודתית לתגובת עקה חמצונית

1. הגדר תרביות לילה של הזנים שייבדקו. מוסיפים 2 מ"ל ציר ליברות למבחנות בגודל 16X150 מ"מ (אחת לכל זן) ומחסנים במושבה מבודדת אחת מכל זן. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C עם אוורור על מסובב תרבית רקמה באינקובטור אוויר.
2. מדוד את OD₆₀₀ של תרבויות הלילה. לשטוף תרביות לפני נטילת קריאות OD₆₀₀ כדי לחסל pyomelanin נוכח בתקשורת.
3. שטפו את התרביות על ידי צנטריפוגה של 1 מ"ל תרבית במיקרו-צנטריפוגה במהירות של 16,000 x גרם למשך 2 דקות. הסירו את הסופרנאטנט ואת כל התאים בעלי הכדוריות הרופפות בעזרת מיקרו פיפטור, והשהו מחדש את כדורית התא המוצק ב-1 מ"ל ליברות.
4. למחרת, הכינו צלחות אגר LB המכילות H₂O₂ כגורם עקה חמצוני. טווח של ריכוזי H₂O₂ מ 0 עד 1 mM הוא נקודת התחלה טובה.
   1. ממיסים את צלוחיות האגר LB. מצננים את חומרי ההדפסה לטמפרטורה של כ-50°C בטמפרטורת החדר.
   2. הוסף H₂O₂ ישירות למדיה המקוררת בריכוזים הרצויים. מערבלים צלוחיות לערבוב. ראו טבלה 1 לריכוזים של H₂O₂ ונפחים של מרוכזים H₂O₂ להוסיף. ערכים אלה מבוססים על 100 מ"ל של אגר LB.
   3. יוצקים צלחות מיד לאחר הוספת H₂O₂ ומבעירים את המשטח כדי להסיר בועות. התשואה היא 4 צלחות לכל 100 מ"ל של אגר LB. סמן את הלוחות בריכוז H₂O₂.
   4. הניחו את הצלחות חשופות במכסה מנוע עם זרימה ביולוגית כאשר המאוורר פועל במשך 30 דקות כדי להסיר לחות עודפת מהצלחות.
      הערה: השתמש בצלחות באותו יום שבו הן מוכנות. כישלון לעשות זאת עלול לגרום לנתונים לא עקביים.
      הערה: ניתן להחליף גורמי עקה חמצוניים כגון פרקוואט ב- H₂O₂ בבדיקה זו. הריכוזים המשמשים לעקה חמצונית אחרים עשויים להיות שונים מאלה המשמשים עבור H₂O₂.
5. שטפו ומדדו את OD₆₀₀ של תרביות הלילה.
6. נרמלו את OD₆₀₀ של כל תרביות הלילה לערך הנמוך ביותר עבור קבוצת הזנים הנבדקים. P. aeruginosa בדרך כלל יש OD₆₀₀ של כ 2.5 כאשר גדל לילה LB.
   1. קבע את נפח התרבית הדרוש כדי לדלל את התרבית ל- OD₆₀₀ הנמוך ביותר בנפח כולל של 1 מ"ל. לדוגמה, אם לתרבית יש OD₆₀₀ מתוך 3 וה-OD₆₀₀ הנמוך ביותר עבור קבוצת הזנים הוא 2.5, בצע את החישוב הבא: (2.5)(1 מ"ל) = (3)(x). x = 0.833 מ"ל. 0.833 מ"ל של תרבית יונחו בצינור מיקרופוגה.
   2. חשב את כמות LB + DMSO הדרושים כדי להביא את נפח התרבית ל 1 מ"ל. לדוגמה בשלב 4.4.1, כמות LB + DMSO שתתווסף לתרבית תהיה 0.167 מ"ל (נפח כולל של 1 מ"ל – 0.833 מ"ל תרבית). הפוך פתרונות מלאי של LB + DMSO לשימוש עבור דילולים אלה בהתבסס על הנפח הדרוש לדילול כל הזנים.
   3. מערבבים את התרבית ואת LB + DMSO על ידי מערבולת.
7. כדי לשמור על תרבויות בריכוז קבוע של DMSO, בצע דילולים סדרתיים פי עשרה של תרביות הלילה המנורמלות ב- PBS + DMSO.
   1. הפוך פתרון מלאי של PBS + DMSO. עבור קבוצה אחת של דילולים עבור זן אחד, ערבבו נפח של 300 מיקרומטר של DMSO עם PBS כדי להפיק נפח כולל של 720 מיקרוליטר. קנה מידה של מניות אלה למעלה או למטה בהתאם למספר הזנים שנבדקו.
   2. יש לסמן שפופרות מיקרופוגה עבור ^10-1 עד ^10-7 דילולים טוריים. הוסף 90 μl של PBS + DMSO לצינורות המתאימים. השתמש PBS + DMSO עבור זנים הגדלים LB + DMSO.
   3. הוסף 10 μl של תרבית לצינור דילול ^10-1 המתאים. מערבבים על ידי מערבולות ומעבירים 10 μl של דילול ^10-1 לצינור דילול ^10-2. חזור על הפעולה עד לביצוע כל הדילולים. החליפו קצוות פיפט בין דילולים.
8. נקודה 5 μl של ^10-3 עד ^10-7 דילולים על LB + H₂O₂ לוחות כפולים עבור כל זן. השתמשו בקצה צינור אחד אם הכתמים מצופים מרוב המדוללים להכי פחות מדוללים (^10-7 עד ^10-3). אין להטות או להטות את הצלחת עד שהנוזל מתייבש לתוך הצלחת.
9. לדגור על הצלחות במשך 24-48 שעות ב 37 ° C (אינקובטור אוויר), בהתאם למתח.
   הערה: P. aeruginosa PAO1 יהיו מושבות בגודל טוב על LB לאחר 24 שעות של דגירה. דוגרים על זנים עד שיש להם מושבות בערך באותו גודל כמו PAO1.
10. צלם את הלוחות באמצעות מצלמת CCD מעל טרנסלומינטור. לחלופין, ערוך את התמונות עבור ניגודיות וחתוך אותן לאותו גודל. ספרו את מספר המושבות בכל נקודה כדי לקבוע שינויים ברגישות לעקה חמצונית.

טבלה 1: ריכוזים של H₂O₂ שיש להוסיף לאגר LB עבור בדיקת לוחית נקודת העקה החמצונית. טבלה זו נותנת ריכוזי H₂O₂ שונים ואת הכמות המתאימה של ציר H₂O₂ מרוכז להוסיף לאגר 100 מ"ל LV.

ריכוז סופי של H2O2 (mM)	כמות של 9.79 M H2O2 (30% wt) להוסיף (μl)
0	0
0.2	2.04
0.4	4.09
0.6	6.13
0.8	8.17
1	10.21

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	סיגמא-אולדריץ'	SML0269-50 מ"ג	נקרא גם ניטיסינון. מסיס ב-DMSO.
ח2O2	סיגמא-אולדריץ'	216763-100 מ"ל	30 wt.% ב- H2O. התייצב.