$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. זן חיידקים ומדיום גידול
- הכינו דקסטרוז אלבומין ותמיסת מלאי מלח (ADS) על ידי המסיסה של 25 גרם אלבומין בסרום בקר, 10.0 גרם דקסטרוז ו-4.05 גרם נתרן כלורי ב-460 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה. סנן וחטא את ADS ואחסן אותו בטמפרטורה של 4°C.
- הכינו ציר 7H9 על ידי הוספת 4.7 גרם אבקת 7H9 ו-2 מ"ל גליצרול ל-900 מ"ל מים מטוהרים. הוציאו את המרק 7H9 בטמפרטורה של 121°C למשך 10 דקות והניחו לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שתמשיכו. צור 7H9ADST על ידי הוספת 100 מ"ל ADS ו- 0.5 מ"ל של Tween80 עד 900 מ"ל של מרק 7H9. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
- שוקלים 50 מ"ג של קנמיצין סולפט וממיסים אותו ב 1 מ"ל של מים deionized; הריכוז הסופי הוא 50 מ"ג / מ"ל. יש לסנן-לעקר ולאחסן בטמפרטורה של -20°C. יש להוסיף 0.5 מ"ל של תמיסת מלאי kanamycin לכל 1 ליטר של 7H9ADST.
הערה: מדיום זה צריך להיות טרי, ולכן קנה את הכרכים בהתאם לגודל התרבות.
- לגדל M. tuberculosis ב 7H9ADST בתוספת kanamycin בתרבית עומדת. נערו את התרבית מדי יום ודללו אותה לפני שה-OD600 מגיע ל-1.0 כדי למנוע היווצרות גושים.
הערה: זן השחפת M. ששימש לפיתוח שיטה זו היה H37Rv שעבר טרנספורמציה עם פלסמיד pJAK2.A. pJAK2.A הוא פלסמיד אינטגרטיבי המבוסס על וקטור pMV361, המאפשר ביטוי ברמה גבוהה של הגן לוציפראז הגחלילית ממקדם hsp60 וניתן לבחור אותו באמצעות קנמיצין.
2. ניתוח פעילות במרק באמצעות בדיקת רסזורין
- לגדל M. שחפת ב 7H9ADST לשלב אמצע יומן (~ 0.5 - 0.8 OD600). דלל את התרבית עם 7H9ADST עד 0.01 OD600. לדלל את התרכובות ב 7H9ADST עד פי 2 מריכוזי הבדיקה ו aliquot 100 μL של כל תרכובת מדוללת לתוך כל באר.
- מעבירים 100 μL של התרחיף החיידקי המדולל לכל באר. אפשר לצלחות לדגור ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח במשך 5 ימים. להמיס 10 מ"ג של resazurin ב 100 מ"ל של מים deionized מסנן סטרילי.
- הוסף 30 μL של פתרון resazurin ולפקח על שינוי הצבע לאחר 48 שעות; צמיחת חיידקים מסומנת על ידי המרת צבע מכחול לוורוד.
הערה: ניתוח כמותי יכול להתבצע גם על ידי מדידת הפלואורסצנטיות ב 590 ננומטר עם עירור ב 530 - 560 ננומטר או את הספיגה ב 570 ננומטר ו 600 ננומטר.