מדידת TEER בתאי אפיתל המוקרנים בקרני רנטגן בתרבית משותפת עם PBMCs

תקציר

מקור: Babini, G., et al. שיטת תרבית משותפת לחקר השיחה בין תאי Caco-2 המוקרנים בקרני רנטגן לבין PBMC. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים את מדידת ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתל בתאי Caco-2 מוקרנים, הן בנוכחות והן בהיעדר תאי PBMC. שיטה זו מאפשרת לחקור את ההשפעות הסינרגיסטיות של קרינה ותאי חיסון על מחסום תאי האפיתל.

פרוטוקול

1. הגדרת הקרנה

הערה: הקרנה של תאי Caco-2 בוצעה במחלקת הרדיותרפיה של Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (פאביה, איטליה) עם מאיץ ליניארי המשמש באופן שגרתי לטיפול בסוגים שונים של סרטן.

1. הגדר את אנרגיית קרני הרנטגן של הפוטון לשיא של 6 MV. המאיץ הליניארי פועל במשטר פעימות (זמן בין שתי פעימות רצופות כ-4 מילישניות; משך פעימה בודדת כ-5 מיקרו-שניות עם קצב מינון של עד 1 × ^10-3 Gy/p).
2. מניחים את לוחות 6 הקידוחים המכילים תוספות עם Caco-2 על מסלול קרני רנטגן על יריעת פרספקס בעובי 1.4 ס"מ (המקבילה למרחק הגדול במעט מהצטברות הקרינה המשומשת) במרחק של 100 ס"מ ממקור הקרינה.
3. הניחו בולוס בעובי 0.5 ס"מ על כל דגימה לפני התרחשות הקרינה, כדי להבטיח את רכיב הקרינה המפוזרת לאחור ואת שיווי המשקל של החלקיקים הטעונים.
4. להקרין את התאים (מינונים בטווח 2 - 10 Gy) עם שדה קרינה שטוח וסימטרי (± 2%) 20 x 20 ס"מ וקצב מינון של 3 Gy/min.
   הערה: בקרת "דמה" - תאים מוקרנים עברו את אותם תנאים פרוצדורליים של אלה שהוקרנו, מבלי להיכנס לחדר ההקרנה (קיבל מנה: 0 Gy).
   זהירות: מכשירים מייצרי קרינה מייננת חייבים לשמש רק על ידי צוות מיוחד.

2. התנגדות חשמלית טרנס-אפיתל (TEER)

1. זרעים 5 × 10⁵ תאי Caco-2 שבוע לפני ההקרנה בתוספות תרבית משותפת של צלחת 6 בארות (פוליאתילן טרפתאלט (PET), 2 x 10⁶ נקבוביות לסמ"ר).
2. 1 שעות לפני הקרנה, למדוד את TEER עם מד מתח / אוהממטר.
3. להקרין תאים כמתואר בשלבים 1.1 - 1.4.
4. לדגור על תאי Caco-2 בנוכחות/היעדר תרבית משותפת עם PBMC בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה המכילה 5% CO₂.
5. בשעות הראשונות שלאחר הקרינה, יש למדוד TEER כל שעה, ולאחר מכן כל 3 שעות עד 48 שעות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ThinCert 6 תוספות תרבית תאים היטב עבור צלחות מרובות באר	גריינר ביו-וואן	657610	ציוד
צלחת Multiwell תרבית תאים, 6 באר	גריינר ביו-וואן	657160	פלסטיק
צלחת Multiwell תרבית תאים, 24 באר	גריינר ביו-וואן	662160	פלסטיק
RPMI 1640 ללא L-גלוטמין	לונזה	12-167F	ריאגנטים
מיליצל-ERS מד מתח/אומטר	מיליפור	MERS 00001	ציוד