בדיקת ביופילם של צלחת יתד להקרנת חומרים אנטיבקטריאליים

תקציר

מקור: Dalecki, A. G., et al. התמקדות בביופילם הקשור Staphylococcus aureus באמצעות Resazurin מבוסס תרופות רגישות Assay. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים בדיקה לסינון תרכובות אנטי-מיקרוביאליות שמחסלות ביעילות ביופילמים באמצעות לוחית יתד. המתודולוגיה מנטרת את המצב המטבולי של הביופילם לאחר הטיפול בתרכובות מיקרוביאליות, מה שמקל על קביעת ריכוז מיגור הביופילם המינימלי.

פרוטוקול

1. חניכת ביופילם

1. לגדל תרבית של אורגניזמים מייצרי ביופילם במדיום עשיר בחומרים מזינים. חיסון זן Staphylococcus aureus ניומן ב 10 מ"ל של מדיום מולר-הינטון ממלאי גליצרול. לבצע את כל העבודה הכרוכה בטיפול ב- S. aureus עם כפפות ובתוך ארון בטיחות ביולוגית.
2. יש לדגור במשך 16 שעות ב-37°C על שייקר סיבובי (100-200 סל"ד).
3. קבע OD₆₀₀ של התרבית באמצעות ספקטרופוטומטר וקובט סטנדרטי (אורך נתיב: 1 ס"מ).
4. חשב את נפח (V) התרבית הדרוש להכנת 20 מ"ל של חיסון עם OD_{600 (inoculum)} של 0.1 במדיה של מכון הזיכרון רוזוול פארק (CRPMI) באמצעות הנוסחה: [V = 20 ml * 0.1 / OD_{600 (תרבית)}].
   1. הוסף את נפח התרבית המחושב (מלמעלה) לצינור צנטריפוגה ולתאי גלולה על ידי סיבוב במשך דקה אחת במהירות של 10,000 x גרם. כדי להכין חיסון ביופילם, לשאוף את מדיום הצמיחה בילה להשעות מחדש את גלולת התא ב 20 מ"ל CRPMI.
5. יוצקים אינוקולום למאגר של 25 מ"ל.
6. הסר בזהירות את המכסה מצלחת יתדות סטרילית של 96 בארות על ידי משיכת אותו ישר למעלה.
   הערה: יש להקפיד שלא לזהם את היתדות התלויות מהמכסה. ניתן להניח את המכסה הפוך על משטח נקי בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
7. באמצעות פיפטה רב ערוצית של 200 μl, הוסף 125 μl inoculum לכל באר של שורות A עד G של הצלחת התחתונה.
8. מלא 125 μl מדיום CRPMI סטרילי בכל באר של שורה H כבקרת סטריליות.
9. קח את מכסה היתדות והחזק אותו מעל תחתית הצלחת כשהיתדות פונות כלפי מטה. יישרו בזהירות את היתדות הבודדות עם הבארות המתאימות. הימנעו ממגע פיזי בין הצלחת ליתדות. לאחר היישור, הנמיכו את המכסה בזהירות כלפי מטה. הימנע מחוסר התאמה מכיוון שהתאמות מחדש המבוצעות לאחר שהיתדות נגעו בלוח התחתון עלולות לזהם את בקרות הסטריליות בשורה H.
10. אטמו את מכסה הצלחת בסרט פרפין למניעת אידוי והכניסו אותו לשקית ניילון אטומה, תוך אטימה הדוקה. שמרו על נפח אוויר נמוך ככל האפשר בשקית כדי למזער אידוי.
11. יש לדגור ללא טלטול בטמפרטורה של 37°C למשך 48 שעות באינקובטור CO₂ של 5%.
    הערה: 48 שעות של צמיחה היו אופטימליות עבור S. aureus, אך ישתנו בהתאם לאורגניזם המשמש.
    הערה: למרות שדגירה סטטית היא נקודת התחלה טובה לייעול הבדיקה, רעידה עדינה ב-150 סל"ד על שייקר מיקרו-פלטה היא וריאציה אפשרית שעשויה לשפר את היווצרות הביופילם של כמה מבודדי S. aureus.

2. הכנת צלחת אתגר הביופילם

1. ביום אתגר הביופילם קחו צלחת טרייה בת 96 בארות והוסיפו 100 μl של CRPMI, שווה ערך ל-RT, לכל באר של שורות B עד H. כדי להימנע מתוצאות לא עקביות, השתמש בלוח של 96 בארות שיכול להכיל 200 μl של מדיה כאשר היתדות נמצאות בפנים, וכולל בארות עם ממדים זהים לאלה של לוח אתחול הביופילם.
2. יש לדלל עד 4 תרכובות בדיקה בנפרד ב-1.0 מ"ל CRPMI עד פי 2 מהריכוז הסופי הרצוי, על מנת להביא בחשבון דילול סופי בשלב 2.7.
   הערה: נקודת התחלה טובה היא פי 8 מעל הריכוז המעכב של תאים פלנקטוניים.
3. הוסף 200 μl של מתחם 1 בבארות A1 עד A3, מתחם 2 בבארות A4 עד A6, מתחם 3 בבארות A7 עד A9, ומתחם 4 בבארות A10 עד A12.
4. מדללים באופן סדרתי את תרכובות הבדיקה באמצעות פיפטה רב ערוצית ומעבירים 100 μl משורה A לשורה B ומערבבים.
5. באופן זה, להמשיך להעביר 100 μl היטב היטב. מערבבים לאחר כל העברה ועוצרים בשורה F.
6. לאחר הערבוב, להוציא 100 μl משורה F לתוך מיכל פסולת. אין להעביר נוזלים לשורות G ו-H.
7. הוסף 100 μl של CRPMI לכל באר של הצלחת באמצעות פיפטה רב ערוצית כדי להביא את נפח ל 200 μl. ראו איור 1 לפריסת הלוח הסופית.

3. אתגר הביופילם

1. הוסף 200 μl של מלוחים חוצצי פוספט (PBS) לצלחת סטרילית טרייה בת 96 בארות הכוללת בארות בממדים זהים לאלה של לוח התחלת הביופילם.
2. הסר את שקית הניילון ואת סרט הפרפין מצלחת התחלת הדגירה של הביופילם.
3. הרימו את המכסה ישר למעלה. הימנע ממגע בין היתדות לתחתית הצלחת מכיוון שהדבר עלול לפגוע בביופילם. שמור את החלק התחתון לניתוח OD₆₀₀ הבא (ראה 3.8).
4. שטפו תאים פלנקטוניים על ידי הנחת מכסה היתד על הצלחת המכילה PBS (משלב 3.1). השקיעו יתדות במשך 5 שניות, הרימו את היתדות מ-PBS ושקעו שוב, תוך זהירות שלא לפגוע ביתדות בדפנות הבאר.
5. הכניסו את מכסה היתד השטוף לצלחת האתגר. הימנע ממגע מיותר בין יתדות לצלחת התחתונה מכיוון שהדבר יפגע בביופילם ויוביל לתוצאות לא עקביות.
6. אטמו את הצלחת בסרט פרפין והכניסו אותה לשקית ניילון אטומה כמתואר בשלב 1.10.
7. לדגור על הצלחת מבלי לנער במשך 24 שעות ב 37 ° C באינקובטור 5% CO₂.
8. קח את החלק התחתון של צלחת אתחול biofilm מ 3.3. השהה מחדש את החיידקים בכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית ומדוד את OD₆₀₀ עם קורא מיקרו-צלחות מתאים כדי לאשר את הצמיחה המתרחשת בכל הבארות מלבד בקרות הסטריליות בשורה H.

4. קביעת ביופילם

1. השתמש בקורא לוחות המצויד בתא דגירה ומסוגל לקחת קריאות פלואורסצנטיות קינטיות לאיתור המרת רזאזורין. הגדר מדידת פלואורסצנטיות קינטית של 24 שעות באמצעות עירור של 530 ננומטר ופליטה של 590 ננומטר.
2. כוונו את טמפרטורת התא ל-37°C וקראו את הצלחת כל 20 דקות. כוונו את קורא הלוחות למדידה מתחתית הצלחת בהתאם להוראות היצרן.
3. הכינו את צלחת השטיפה על ידי הוספת 200 μl של PBS עם פיפטה רב ערוצית לצלחת סטרילית של 96 בארות.
4. הכן מדיום התאוששות ביופילם על ידי הוספת 400 μl של 0.8 מ"ג / מ"ל תמיסת מלאי resazurin ל 20 מ"ל של CRPMI בינוני לריכוז סופי של 16 מיקרוגרם / מ"ל resazurin.
   הערה: Resazurin הוא מגרה עור ידוע. השתמש במעיל מעבדה, משקפי התזה וכפפות בזמן הטיפול. CRPMI כמדיה לשחזור ביופילם שימש מכיוון שהוא מספק את אות הרקע הנמוך ביותר, אך ניתן להחליף אותו במדיה של מולר הינטון במידת הצורך.
5. הוסף 150 μl של מדיום שחזור ביופילם עם פיפטה רב ערוצית לכל באר של צלחת 96 באר טרייה.
6. מעבירים את פלטת האתגר מהאינקובטור לארון בטיחות ביולוגית ומסירים בזהירות את שקית הניילון וסרט האיטום.
7. הסר את מכסה היתד מלוח האתגר ושטוף תאים פלנקטוניים ב- PBS כמתואר ב- 3.4. שמור את החלק התחתון של לוח האתגר לניתוח OD₆₀₀ עוקב (ראה 4.10).
8. לאחר השטיפה, הניחו את מכסה היתד בתחתית הצלחת המכילה את מדיום שחזור הביופילם.
9. עוטפים את צד הצלחת בסרט פרפין, נזהרים שלא לחסום את תחתית הבארות ההיקפיות. מיד לאחר עטיפת הצלחת, הניחו אותה על קורא הלוחות והתחילו קריאה קינטית במשך 24 שעות על ידי הפעלת הפרוטוקול הקינטי של רסזורין שנעשה קודם לכן משלב 4.1.
10. כדי לכמת את הצמיחה של תאים פלנקטוניים שעשויים להתרחש או לא להתרחש במהלך האתגר, קרא את OD₆₀₀ של כל תחתית צלחת האתגר באמצעות קורא microplate. בצע את ההוראות המפורטות בשלב 3.8.
    הערה: בזהירות להשהות מחדש את התוכן של כל באר כמו תאים להשיל את הביופילם נוטים לגדול בגושים בתחתית הבאר. כל בועות בתוך הבאר יפריעו מאוד לקריאות OD₆₀₀ ויש להימנע מהן או להסיר אותן לפני הקריאה.

תוצאות

איור 1. פריסת צלחת אתגר. פריסה לדוגמה של לוח אתגר המתאים לבדיקה מקבילה של ארבע תרכובות במשולש בשישה ריכוזים נפרדים. בקרות לא מטופלות וסטריליות כלולות גם כן. עיצוב הפריסה תומך בהכנה נוחה בתוך הצלחת של דילולים טוריים באמצעות פיפט רב ערוצי. הריכוזים הם במיקרומטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מולר-הינטון מדיום	אוקסואיד	CM0405	עקוב אחר המלצות היצרן
סל"ד-בינוני	קורנינג	17-105-CV
CRPMI	מספר 10		RPMI-1640 בינוני chelexed במשך 1 שעה עם שרף Chelex 100 ולאחר מכן בתוספת 10% unchelexed RPMI-1640
שרף Chelex 100	ביו ראד	142-2822
MBEC-צלחות	אינובוטק	19111
Resazurin נתרן מלח	סיגמא	₪177	800 מק"ג/מ"ל במים DI מסנן סטרילי
פלטפורמת ניעור צלחת מיקרו	היידולף טיטראמקס 1000
ציטיישן 3 קורא צלחות	ביוטק
תוכנת Gen5	ביוטק		הקלטה וניתוח של המרת resazurin
נאוקופרין	סיגמא	N1501	להכין 10 mM מלאי 100% אתנול, לאחסן ב -80 ºC
נחושת גופרתית	אקרוס אורגניקס	7758-99-8	הכן תמיסת מלאי של 100 מ"מ במים, אחסן ב 4 מעלות צלזיוס
Cu-Neocuproine	תוצרת עצמית		נוצר על ידי ערבוב טוחנות שוות של neocuproine ו נחושת גופרתית. התערובת דוללה במדיום CRPMI לריכוז הרצוי.
גנטמיצין	סיגמא	G3632-1G