בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות חוץ גופית למדידת יעילות האיטום מחדש של קרום הפלזמה

תקציר

מקור: Lam, J. G., et al. מדידת תפוקה גבוהה של יעילות איטום מחדש של קרום פלזמה בתאי יונקים. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים בדיקה לחקר יעילות האיטום מחדש של קרום הפלזמה בתאי יונקים. התאים נחשפים לרעלן חיידקי היוצר נקבוביות, היוצר נקבוביות בקרום התא. בנוכחות יוני סידן חוץ-תאיים, הנקבובית גורמת לזרימת סידן, וגורמת לאירועים של איטום מחדש של הממברנה. יעילות האיטום מחדש מוערכת באמצעות צבע פרופידיום יודיד קושר DNA, אשר נכנס רק לתאים ללא קרום אטום מחדש.

פרוטוקול

1. הכנה

1. ציפוי תאים
   הערה: תאי אפיתל צוואר הרחם האנושיים, HeLa ו- HeLa המבטאים Histone 2B-GFP (H2B-GFP), שימשו בפרוטוקול זה, אך ניתן להתאים בדיקה זו לתאי יונקים אחרים.
   1. נתק תאים דבקים מבקבוק תרבית^{תאים בגודל 75} ס"מ על ידי שטיפת התאים עם 2 מ"ל של טריפסין-EDTA 0.25%. החלף את הטריפסין המשומש עם 2 מ"ל של טריפסין-EDTA טרי 0.25%.
   2. דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות עד שהתאים מתעגלים ומתנתקים מהצלוחית.
   3. יש להשהות מחדש את התאים ב-8 מ"ל של מדיום גדילה (DMEM המכיל 10% נסיוב בקר עוברי מומת חום, 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין).
   4. לקבוע את ריכוז התא באמצעות hemocytometer ו 10 μL של השעיית התא.
   5. לדלל את התאים במדיום גידול לריכוז של 2.5 x 10⁵ תאים / מ"ל.
   6. יוצקים את תרחיף התא לאגן פיפטה סטרילי ומערבבים היטב את התרחיף באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל.
   7. באמצעות מיקרופיפטה רב-ערוצית 12 וקצוות של 200 μL, מפזרים תאי HeLa (2.5 x 10⁴ תאים/100 μL/well) במשולש (או מרובע) בצלחת שטוחה, שקופה, בעלת 96 בארות, תחתית שקופה, רקמת פוליסטירן שחורה שטופלה בתרבית.
      הערה: סידור ציפוי מוצג כדוגמה באיור 1.
   8. תרבית את התאים במשך 24 שעות באינקובטור תרבית תאים לח ב 37 ° C ו 5% CO₂.
2. הכנת פתרון מלאי
   1. הכינו 1 ליטר של מלאי 10x של חיץ M (המשמש להכנת M1 ו-M2) על ידי הוספת 95 גרם של תמיסת מלח מאוזנת Hanks, 0.476 גרם של MgCl₂ (5 מ"ל), ו-23.83 גרם HEPES (100 מ"ל) עד 900 מ"ל מים. כוונן את ה- pH ל- 7.4 והעלה את עוצמת הקול ל -1 ליטר. סנן סטריליזציה.
   2. הכן 50 מ"ל של מלאי 50x (1.25 M) של גלוקוז על ידי הוספת 11.26 גרם של D-(+)-גלוקוז לסך של 50 מ"ל מים. סנן לעקר את הפתרון.
   3. הכינו 50 מ"ל ממלאי סידן של 100x (120 מ"ל) על ידי הוספת 0.666 גרם של CaCl₂ לסך של 50 מ"ל מים. סנן לעקר את הפתרון.
   4. הכינו 50 מ"ל של מלאי של 10x (50 mM) של אתילן גליקול-ביס(2-aminoethylether)-N,N,N',N', חומצה טטראצטית (EGTA) על ידי הוספת 0.951 גרם של EGTA ל 40 מ"ל מים. הגדל את ה- pH ל 8 באמצעות NaOH כדי להמיס את EGTA, ולאחר מכן להעלות את עוצמת הקול ל 50 מ"ל. סנן לעקר את הפתרון.
   5. עבור צלחת אחת של 96 בארות, להכין 50 מ"ל של בינוני 1 (M1, מכיל Ca²⁺), 50 מ"ל של בינוני 2 (M2, Ca^{2 +} חינם), ו 15 מ"ל של בינוני 2 בתוספת EGTA, בהתאם:
      1. עבור M1, הוסף 5 מ"ל של 10x Buffer M, 0.5 מ"ל של 100x CaCl₂, ו- 1 מ"ל של גלוקוז 50x ל- 43.5 מ"ל מים.
      2. עבור M2, הוסף 5 מ"ל של 10x Buffer M ו- 1 מ"ל של גלוקוז 50x ל- 44 מ"ל מים.
      3. עבור M2/EGTA, יש להוסיף 1.5 מ"ל של 10x Buffer M ו-1.5 מ"ל של 10x EGTA ל-12 מ"ל מים.
         הערה: יש להכין את כל התמיסות המכילות פרופידיום יודיד (PI) ישירות לפני הוספה לתאים.
3. קורא לוחות/הגדרות ציטומטר הדמיה
   הערה: השתמש בקורא לוחות רב-מצבי המצויד בשתי יחידות גילוי: ספקטרופלואורומטר וציטומטר הדמיה. הגבילו את החשיפה לפלואורסצנטיות כדי למנוע הלבנה של הפלואורופורים.
   1. מחממים מראש את קורא הלוחות ל-37°C לפני ביצוע הבדיקה.
   2. הגדר את הפרמטרים עבור הבדיקה הקינטית בהתאם במצב הגדרות:
      1. בחר Monochromator, FL (fluorescence) ו- Kinetic עבור התצורה האופטית, מצבי קריאה וסוג קריאה, בהתאמה.
      2. תחת הגדרות אורך גל, בחר פס פס עירור ופליטה של 9 ו- 15 ננומטר, בהתאמה. עבור בדיקות המשתמשות בפרופידיום יודיד (PI), הגדר את אורכי גל העירור והפליטה ל- 535 ו- 617 ננומטר, בהתאמה.
      3. תחת סוג לוחית, בחר 96 בארות עבור תבנית הצלחת ותצורת צלחת מוגדרת מראש המתאימה ללוח תחתון שקוף בעל דופן שחורה.
      4. תחת אזור קריאה, הדגש את הבארות שינותחו ברחבי הקינטי.
      5. תחת PMT ואופטיקה, הגדר מראש את ההבזקים לכל קריאה ל- 6 וסמן את התיבה עבור קריאה מלמטה.
      6. תחת תזמון, הוסף 00:30:00 בתיבה זמן ריצה כולל עבור בדיקה קינטית של 30 דקות, והוסף 00:05:00 עבור מרווח המרווח.
         הערה: עבור כל נקודת זמן ואורך גל אחד, זמן הקריאה של לוח מלא של 96 בארות הוא 30 שניות.
      7. אשר את ההגדרות שצוינו בפרטי ההגדרות משמאל ובחר אישור. לחץ על קרא כדי להתחיל את הריצה הקינטית.
   3. הגדר את פרמטרי ההדמיה בהתאם במצב הגדרות:
      1. בחר Minimax, Imaging ו- Endpoint עבור התצורה האופטית, מצבי קריאה וסוג קריאה, בהתאמה.
      2. תחת אורכי גל, בחר אור משודר, ובאחת מהתיבות הפלואורסצנטיות המתאימות לעירור ולאורכי גל פליטה של 456/541 ננומטר (GFP) ו- 625/713 ננומטר (PI).
      3. השתמש באותן אפשרויות עבור סוג לוח ואזור קריאה כפי שהוגדרו בשלבים 1.3.2.3 ו- 1.3.2.4.
      4. תחת הגדרת אזור באר, בחר את מספר האתרים בתוך באר שיש לצלם.
         הערה: 12 אתרים מתאימים לתמונה מלאה.
      5. תחת הגדרות רכישת תמונה, בחר את זמני החשיפה של האור המשודר, 541 (GFP) ו- 713 (PI). עבור GFP, צלם את הבאר כולה עם זמן חשיפה של 20ms/image. עבור אור מועבר (TL) ו PI fluorescence, לרכוש תמונה אחת של המרכז של כל באר עם זמני חשיפה של 8 ו 20 ms, בהתאמה.
      6. אשר את ההגדרות שצוינו בפרטי ההגדרות משמאל ובחר אישור. זמן הרכישה להדמיה של כל פני השטח של כל באר (12 תמונות / באר) של צלחת 96 בארות ולאורך גל אחד הוא ~ 15 דקות. הקש על Read כדי להתחיל imaging.
         הערה: זמן הרכישה של תמונה בודדת / באר של צלחת 96 באר דורש ~ 2.5 דקות / צלחת עבור אורך גל אחד. הפרמטרים המתוארים לעיל תואמים את הציוד הספציפי במעבדה שלנו. מדידות ספקטרופלואורומטריות: מנורת פלאש קסנון המציגה אורכי גל עירור בהפרש של 1.0 ננומטר (250-850 ננומטר) עם פס פס מתכוונן של 9 או 15 ננומטר, גלאי צינור מכפיל אור עם טווח דינמי של > 6 לוג, ופס פס פליטה מתכוונן של 15 או 25 ננומטר. ציטומטר הדמיה: מקור אור תאורה המסוגל לספק אור לבן, אורכי גל עירור של 460 ננומטר ו-625 ננומטר עם פס פס של 20 ננומטר, מסנני פליטה הממורכזים בפסים של 541 ננומטר (פס פס של 108 ננומטר) ו-713 ננומטר (פס פס של 123 ננומטר), בהתאמה, ומטרה של פי 4 המשולבת למצלמת מכשיר עם צימוד טעינה של 1.25 מגה-פיקסל של 12 סיביות.

2. Assay

הערה: בזמן הבדיקה, התאים חייבים להיות 70-90% במפגש. במהלך שלבי השטיפה, יש להסיר את המדיום ולהחיל אותו על הקיר הצדדי של הבאר (לא ישירות מעל התאים). שמור על הטמפרטורה של LLO ב < 4 ° C כדי למנוע הצטברות שלה עד שלב 3.1.5.

1. הכינו מלאי של 30 μM PI ב-M1 ומלאי של 30 μM PI ב-M2 שחומם מראש ב-37°C.
2. שטפו בעדינות את התאים בצלחת 1 באמצעות מיקרופיפטה רב-ערוצית 12 וקצוות 200 μL, כדלקמן:
   1. לתנאים מתירניים לתיקון, הסירו את מדיום הגידול ושטפו את התאים פעמיים עם 200 μL/well M1 שחומם מראש ב-37°C. החליפו את המדיום ב-100 μL/well של M1 חם המכיל 30 μM PI.
   2. לתיקון תנאים מגבילים, הסירו את מדיום הגידול ושטפו את התאים פעם אחת עם 200 μL/well warm M2 המכיל 5 mM EGTA לתצבית Ca²⁺, ולאחר מכן שטיפה אחת עם 200 μL/well M2. החלף את המדיום ב-100 μL/חם היטב M2 המכיל 30 μM PI.
   3. לאחר שמדיום הגידול נשטף והוחלף במדיום המכיל יודיד פרופידיום, יש לעבור ישירות לשלב 2.1.3.
3. לוח תמונה 1 תחת אור משודר, GFP ו-PI כמפורט תחת 1.3.3 (טרום קינטי). שלב זה אורך 15-20 דקות.
4. במהלך פרק הזמן של 15 דקות בשלב 2.1.3, הכינו את צלחת 2 באמצעות מיקרופיפטה רב-ערוצית 12 וטיפים של 200 מיקרוליטר באופן הבא:
   1. מניחים מיקרו-צלחת פוליפרופילן תחתונה עגולה 96 בארות על קרח. הגדר את הצלחת באמצעות תכנון ניסיוני המתאים ללוח 1 (איור 1).
   2. לתנאים מתירניים לתיקון, יש להוסיף 100 μL/באר של M1 קר כקרח המכיל 60 μM PI, ולאחר מכן להוסיף 100 μL/well של M1 קר כקרח המכיל 4x LLO או לא עבור הבקרה.
   3. לתנאים מגבילי תיקון, יש להוסיף 100 μL/well של M2 קר כקרח המכיל 60 μM PI, ולאחר מכן להוסיף 100 μL/well של M2 קר כקרח המכיל 4x LLO או לא עבור הבקרה.
5. לאחר הדמיה צלחת 1 (שלב 2.1.3), הניחו אותה מיד על קרח, תוך שימוש ברדיד אלומיניום כדי להפריד את הצלחת ממגע ישיר עם קרח. תנו לצלחת 1 להתקרר למשך 5 דקות.
6. באמצעות מיקרופיפטה רב-ערוצית 12 וקצוות 200 μL, מעבירים 100 μL מכל באר לצלחת 2 (שלב 2.1.4) לבארות המתאימות בצלחת 1. כדי להפיץ כראוי את הרעלן במדיה של צלחת 1, הכנס את הקצוות מתחת למניסקוס ולהוציא בעדינות את עוצמת הקול מבלי להכניס בועות.
   הערה: אין לבצע פיפטה למעלה ולמטה, מכיוון שהדבר עלול לנתק את התאים בשוגג.
7. השאירו את הצלחת למשך דקה נוספת כדי לאפשר לרעל להיקשר לתאים והעבירו מיד את צלחת 1 לקורא הלוחות עבור הבדיקה הקינטית באמצעות מצב ספקטרופלואורומטר (שלב 1.3.2).
8. בסוף הבדיקה הקינטית, מיד תמונה צלחת 1 (פוסט-קינטית) באמצעות שלב 1.3.3.

3. ניתוח: ספירת תאים

1. קבע את ספירת התאים בהתבסס על הפלואורסצנטיות הגרעינית באמצעות תוכנת ספירת תאי המיקרו-לוחית.
   1. בתוך הגדרות, בחר ניתוח מחדש, ותחת מקטע הקטגוריות בתוך הגדרות ניתוח תמונה, בחר ניתוח אובייקטים דיסקרטי באמצעות 541 כאורך הגל לחיפוש אובייקטים.
   2. בתוך האפשרות 'חפש אובייקטים', באמצעות השיטה 'צייר על תמונות', בחרו Nuclei תחת הכרטיסיה 'הגדרות' והקישו Apply.
   3. לחץ על OK ו- Read כדי להפעיל את אלגוריתם ספירת התאים.

תוצאות

איור 1: תכנון ניסויי. דיאגרמת הזרימה מתארת עיצוב לוח מייצג המוגדר לבדוק את ההשפעה של שבעה תנאי בדיקה בהשוואה לתאי בקרה שאינם מטופלים. יש לכלול בקרות נוספות במידת הצורך, כמו למשל רכבי סמים. התאים מצופים (צלחת 1) 24 שעות לפני הניסוי. ביום הניסוי, תאים בצלחת 1 נשטפים עם M1 או M2 בינוני מחומם מראש ב 37 ° C, ואת הצלחת הוא imaged (TL, GFP, ו PI fluorescence) pre-kinetic. במהלך 15 דקות ההדמיה, ריאגנטים מתוו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קורא Microplate מרובה מצבים SpectraMax i3x	התקנים מולקולריים	i3x
ציטומטר הדמיה MiniMax 300	התקנים מולקולריים	5024062
טו-פרו-3	תרמופישר סיינטיפיק	T3605
פרופידיום יודיד	תרמופישר סיינטיפיק	P3566
הלה	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	מיליפור	SCC117
טריפסין-EDTA 0.25%	תרמופישר סיינטיפיק	25200056
96-באר קורנינג תחתון שטוח שחור פוליסטירן רקמה צלחת מטופלת צלחת מטופלת	קורנינג	3603
המלחים המאוזנים של הנקס	סיגמא-אולדריץ'	H4891
EGTA	ISC ביואקספרס	0732-100 גרם
HEPES	פישר סיינטיפיק	BP310-500
D-(+)-גלוקוז, HybriMax	סיגמא-אולדריץ'	G5146-1KG