מכתים אימונוהיסטוכימיים לזיהוי אנטיגנים של נגיף הכלבת

תקציר

מקור: Niezgoda, M. et al., בדיקת אימונוהיסטוכימיה לזיהוי אנטיגן Lyssavirus מרקמות קבועות פורמלין. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים צביעה אימונוהיסטוכימית לזיהוי אנטיגן של נגיף הכלבת ברקמת מוח עכבר נגועה. התהליך כולל דה-פרפיניזציה וטיפול באלכוהול, ולאחר מכן טיפול פרוטאוליטי לשיפור נגישות האנטיגן. צביעה אימונוהיסטוכימית מגלה משקעים אדומים, המאשרים את נוכחותם של אנטיגנים כלבת בסעיף הרקמות.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. קיבוע פורמלין של רקמות

1. הכניסו רקמות מוח בקוטר 3-5 מ"מ שנאספו לאחר נקרופסי לתמיסת פורמלין חוצצת פוספט 10% (יחס רקמות/פורמלין 1:20 עד 1:50) למשך 24-72 שעות
   זהירות: פורמלין הוא חומר קיבוע רעיל.
2. רשום את משקל הרקמה המשוער (גודל), סוג הרקמה (אזורי המוח) ונפח הפורמלין. חשוב למעבדות לתעד ולשמור רשומות על זמני קיבוע.
3. לאחסון רקמות ארוך יותר לאחר קיבוע פורמלין ולפני עיבוד, הניחו את הרקמה באתנול 70%.

2. עיבוד רקמות

1. לאחר קיבוע הדגימה, נתחו את הרקמה כך שתכלול את אזורי המוח החשובים, למשל חתכי רוחב של גזע המוח, המוח הקטן (3 אונות) או ההיפוקמפוס (שניהם היפוקמפיים) שכל אחד מהם נחתך בעובי של 3 עד 5 מ"מ והוכנס לקלטות עיבוד.
2. מעבדים את קלטות הרקמה לחדירת שעוות פרפין, מוטמעות בגושי פרפין וחותכות (3 עד 6 מיקרומטר) על מיקרוטום.

3. הכנת חומרים / צביעת כלים

1. הגדירו את צלחת הצביעה (טבלת חומרים) כפי שמוצג באיור 1. ממלאים כל מנה עם 250 מ"ל של הפתרון.
2. הכנת תמיסת מלאי המצע 3-Amino-9-ethylcarbizole (AEC)
   1. יש להמיס טבליה אחת של 20 מ"ג של 3-אמינו 9-אתילקרבזול (AEC) ב-5 מ"ל של N,N, דימתילפורממיד באמצעות פיפטה מזכוכית.
      זהירות: AEC הוא חומר מסרטן.
3. הכנת תמיסת מלאי פרוטאז (למשל, Pronase) לשליפת האנטיגן
   1. להמיס 7 מ"ג של פרוטאז ב 200 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS).
4. הכנת חיץ השטיפה PBS-T
   1. הוסף 10 מ"ל של טווין 80 עד 990 מ"ל של PBS. מערבבים אותו היטב כדי ליצור פתרון הומוגני.

4. Deparaffinization ו rehydration

רקמות

1. הכינו קטע פרפין של 5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום, צפו אותו על אמבט מים בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס ואספו אותו על מגלשות זכוכית. תייג את השקופיות בעט/סמן עמיד בפני ריאגנטים.
2. מניחים את המגלשות על מגש וממיסים בתנור 55-60 מעלות למשך שעה. אין להעלות את הטמפרטורה מעל 60 מעלות צלזיוס כפי שהוא יכול להרוס את האנטיגן הנגיפי.
3. מוציאים את המגלשות מהתנור ומפרקים מיד ב-3 שטיפות קסילן רצופות של 5 דקות כל אחת בכלים 1, 2 ו-3.
4. התייבשו מחדש את החלקים בשקופית על ידי טבילה רציפה בהפחתת דילול אתנול למים נטולי יונים: (4 עד 11 הוא שטיפת טבילה) מנה 4: קסילן/100% אתנול (1:1); מנה 5: 100% אתנול; מנה 6: 100% אתנול; מנה 7: 95% אתנול; מנה 8: 95% אתנול; מנה 9: 80% אתנול; מנה 10: 70% אתנול; מנה 11: מים שעברו דה-יוניזציה (איור 1. הגדרת מנה).
   זהירות: קסילן הוא כימיקל מסוכן והעבודה צריכה להתבצע במכסה אדים.

5. שליפת אנטיגן פרוטאוליטי

1. טפלו בשקופיות עם הפרוטאז (2.5 מיקרוגרם/מ"ל של PBS) למשך 30 דקות לשליפת אנטיגן פרוטאוליטי בצלחת 12.
2. לאחר מכן שטפו ב-PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 13).
3. יש לטפל עם 3% מי חמצן במשך 10 דקות (מנה 14).
4. שוב, לשטוף עם PBS-T במשך 10 דקות (צלחת 15).

6. הליך צביעה

1. טפל בשקופיות אחת בכל פעם, תוך שמירה על שאר השקופיות שקועות במאגר (אל תסיר את כל מחזיק השקופיות - השאר את השקופיות רטובות). הסר שקופית אחת והסר את החיץ העודף (באמצעות מגבת נייר) מסביב לאזור הרקמה, תוך זהירות שלא להפריע למקטע הרקמה. יש לדגור על מגלשות בתא לחות, על ידי הנחת מגבות נייר לחות, על ספסל המעבדה בטמפרטורת החדר עם סרום עיזים רגיל (חוסם) למשך 15 דקות.
2. יש לדגור עם הנוגדן הראשוני האופטימלי נגד כלבת שנקבע מראש (דילול 1:250 של סרום עכבר נגד כלבת, לא פורסם) (בקרה חיובית) ונוגדני בקרה שליליים בטמפרטורת החדר כמו לעיל (שלב 6.1.) למשך 60 דקות ללא שטיפות ביניהם.
3. לאחר 60 דקות, שטפו עם PBS-T למשך 10 דקות (צלחת 16).
4. יש לדגור עם נוגדן ביוטינילציה (ספציפי לזן) בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות (טיפול זהה לשלב 6.1).
5. שטפו עם PBS-T במשך 10 דקות (מנה 16).
6. יש לדגור עם קומפלקס סטרפטאבידין - חזרת פרוקסידאז (HRP) בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות (טיפול זהה ל-6.1).
7. שטפו עם PBS-T במשך 10 דקות (מנה 16).
8. יש לדגור עם מצע פרוקסידז, אמינו-אתילקרבזול (AEC), בתא לחות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. יש לייצר AEC ממש לפני השימוש. לשם כך, הוסף 1 מ"ל של תמיסת מלאי AEC ל- 14 מ"ל של מאגר אצטט 0.1M, pH 5.2. הוסף 0.15 מ"ל של 3% חמצן, H₂O₂. סנן את התערובת ממש לפני השימוש (מסנן 0.45 מיקרומטר).
   הערה: פתרון העבודה של AEC יציב רק במשך 2-3 שעות. ניתן לאחסן את תמיסת מלאי AEC במקרר לפרקי זמן ארוכים יותר.
9. יש לשטוף במים נטולי יונים, למשך 10 דקות (צלחת 17)
10. מוכתם בהמטוקסילין של גיל מדולל 1:2 במים נטולי יונים, במשך 2 דקות (מנה 18).
11. יש לשטוף את עודפי המטוקסילין בשטיפת מים נטולי יונים, לשטוף (כלים 19 ו-20).
12. יש לשטוף במי הברז של סקוט במשך 30 שניות (תמיסת הדבקה) 21.
13. יש לשטוף במים נטולי יונים, למשך 10 דקות (צלחת 22)
14. הסר שקופיות אחת בכל פעם - הר עם אמצעי הרכבה מסיס במים.
15. קרא שקופיות במיקרוסקופ אור.

תוצאות

איור 1: תרשים זרימה המציין שלבים שונים לבדיקת IHC. 

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
3% מי חמצן	מותגי Pharamacy		מהמדף 3% H2O2
3-אמינו-9-אתילקרבזול (AEC)	מיליפור סיגמא	A6926
חוצץ אצטט pH 5.2	פולי סיינטיפיק R&D קורפ	S140
פורמלין חוצץ 10% פוספט חוצץ	פישר סיינטיפיק	SF100-4	מוסמך
החלקות כיסוי קורנינג	פישר סיינטיפיק	12-553-471	24 X 50 מ"מ
אתנול 190 הוכחה	פארמקו-AAPER	111000190
אתנול 200 הוכחה	פארמקו-AAPER	111000200
נוסחת המטוקסילין #2 של גיל	פישר סיינטיפיק	CS401-1D
ערכת HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase	סרקרה	71-00-18	נוגדן ראשוני לעכבר
ImmunoHistoMount	מיליפור סיגמא	i1161	מדיית הרכבה
N,N, דימתיל פורממיד GR	פישר סיינטיפיק	D119
פוספט חוצץ מלוחים	הייקלון	RR14440.01	01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
תוכנית-APOCHROMAT 40X/0.95 מטרה	ספקים מרובים
תוכנית אפוכרומטית 20X/0.75 יעד	ספקים מרובים
פרונאז	מיליפור סיגמא	53702	פרוטאז, סטרפטומיצס גריסוס
מי הברז של סקוט	פולי סיינטיפיק R&D קורפ	S1887
ערכת כתמים של Tissue-Tek Slide	פישר סיינטיפיק	50-294-72
TWEEN-80	מיליפור סיגמא	עמ' 1754
קסילן	פישר סיינטיפיק	X3S-4	ציון היסטולוגי
Zeiss Axioplan 2 הדמיה - מיקרוסקופ	ספקים מרובים