$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנה היסטופתולוגית, ועיבוד לאחר קבלת ביופסיה של עורק זמני
הערה: ביופסיית העורק הרקתי (TAB) מבוצעת בהרדמה מקומית ובתנאים סטריליים על ידי כירורג מוסמך. לאחר קבלת ניתוח קטע עורקי 3 ס"מ בצד הפגוע יותר, הדגימה קבועה בפורמלין מיד במשך 24 שעות, מחולקת לחלקים של 3 עד 4 מ"מ, ומוטבעת בפרפין, תוך שימת לב קפדנית ליישור נכון של רקמה בבלוק אשר מאוחסן לאחר מכן בטמפרטורת החדר. בחירת הדגימות מתבצעת לאחר אימות הרשומות הרפואיות. האבחנה מבוססת על הקריטריונים של הקולג' האמריקאי לראומטולוגיה משנת 1990 הדורשים מהנבדקים למלא 3 מתוך 5 תחומים: גיל >50 שנים, כאב ראש חדש, רגישות בעורקים הרקתיים, קצב שקיעת אריתרוציטים >50 מ"מ לשעה בשיטת ווסטרגרן, וכרטיסייה חריגה. לבטיחות, יש ללבוש כפפות מגן בכל עת בעת הטיפול בדגימות, כימיקלים, ונוגדנים.
- מהבלוקים המשובצים, חותכים חלקים בעובי 4-5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום. וכתם עם Hematoxylin ו Eosin (H&E). השתמש במקטע בקרה של הרקמה הרגילה שנבחרה להבטחת איכות.
- יש לחתוך חלקים באמבט מים חמים המחומם ל-40°C כדי להסיר קמטים ולהרים אותם במגלשה מיקרוסקופית מצופה זכוכית. הניחו את מגלשות הזכוכית על צלחת חמה בתנור בטמפרטורה של 60°C למשך 60 דקות כדי להקל על הייבוש וההיצמדות של החלק למגלשה.
- מניחים את מגלשות הזכוכית על צלחת חמה בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות למשך 60 דקות כדי להקל על הייבוש וההיצמדות של החלק לשקופית.
- הר 3 מקטעים בשקופיות מיקרוסקופ.
- הניחו את המגלשות במדף אנכי וייבשו למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C למשך 24 שעות.
- הניחו שקופיות במיכל ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.
2. הכנה אימונוהיסטוכימית, Dewaxing, שליפת אנטיגן וצביעה
- טען שקופיות למדף שקופיות. הפעל את המדף בין כלים באופן הבא: פעמיים ב 100% קסילן במשך 5 דקות עם 10 שניות של תסיסה עדינה כל 30 שניות, פעם אחת ב 100% אתנול עם 10 שניות תסיסה, פעם אחת ב 90% אתנול עם 10 שניות תסיסה, פעם אחת ב 70% אתנול עם 10 שניות תסיסה, ופעמיים בזיקוק כפול H2O עם 10 שניות תסיסה.
הערה: הטיפול בקסילן ואצטון צריך להיעשות במנדפים מאווררים כדי למנוע שאיפה ורעילות נשימתית.
- יש לאחזר את האנטיגן על ידי העברת המדף למיכל זכוכית עם 200 מ"ל של 10 mmol / L, pH 6.0 ציטראט חימר שחומם מראש ל 95 ° C. הגדר את הטיימר למשך 30 דקות באמבט המים, ואז התקרר בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות ולאחר מכן שטוף עם מים זורמים במשך 5 דקות.
- הסר פעילות פרוקסידאז אנדוגנית על ידי דגירה ב 200 מ"ל של 3% מי חמצן במשך 10 דקות. יש לשטוף שקופיות 3 פעמים ב-200 מיקרוליטר של תמיסת מלח חוצצת טריס (TBSS).
- הסר את המגלשות מהמדף וטפח כל אחת מהן בעדינות כדי לנגב את המאגר העודף. להכתמה, יש להוסיף 200 μL של הנוגדנים הראשוניים הבאים, להוסיף כיסויים על שקופיות ולדגור בתא לח למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר:
נוגדן בטא נגד קולטן פולאט (FRB) מדולל 1:800
עכבר חד שבטי נגד אדם CD68, דילול 1:200
ארנב רב-שבטי אנטי-CD3 1:100 דילול
הערה: חלקים משובצים פרפין קבועים בפורמלין של השליה עובדו גם הם כמתואר בשלבים 2.1 עד 2.9, הודגרו עם anti-FRB18, ושימשו כבקרה חיובית. תוצאות הצביעה התקבלו על ידי מציאת ריכוז הנוגדנים האופטימלי ובוצעו על ידי טיטרציה של הנוגדן בדילול כפול (למשל, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600).
- יש להסיר את הכיסוי לאחר הדגירה ולהשליך. יש לשטוף את המגלשות 3 פעמים במשך 2 דקות כל אחת עם TBSS, לנקז ולנגב את עודפי החוצץ.
- הוסף 200 μL של תמיסת נוגדנים משנית המכילה נוגדן משני אנטי-ארנב/עכבר ביוטינילציה כדי להגיב עם נוגדן ראשוני לא מצומד הקשור לאנטיגן רקמות. הניחו את הכיסויים על מגלשות ודגרו בתא לח במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש להסיר את הכיסוי לאחר הדגירה ולהשליך. יש לשטוף את המגלשות 3 פעמים במשך 2 דקות כל אחת עם TBS, לנקז ולנגב את עודפי החוצץ.
- הוסף 200 μL של diaminobenzidine (DAB) + חיץ מצע (Imidazole HCl) -מערכת כרומוגן ודגר במשך 10 דקות כדי לדמיין את דפוס הצביעה. יש לשטוף עם TBSS ולאחר מכן במי ברז זורמים למשך 10 דקות.
- כתם נגדי עם hematoxylin במשך 3 דקות.
- הרכיבו את השקופיות על ידי החלת 70 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה על פני השטח של המגלשה. הטו באיטיות את הכיסוי על אמצעי ההרכבה והימנעו מיצירת בועות כשאתם מורידים אותו למקומו. יש להמתין 24 שעות לייבוש.
3. ניתוח היסטופתולוגי ואימונוהיסטוכימי (IHC)
בחנו את הקטעים המוכתמים של H&E ו-IHC מנבדקים חיוביים ונורמליים של GCA באמצעות מיקרוסקופ אור.
- עבור המדורים המוכתמים של H&E
- להעריך את ארכיטקטורת כלי הדם ולזהות תאי אנדותל בטוניקה אינטימה, תאי שריר חלק במדיה טוניקה, פיברובלסטים ו vasa vasorum ב tunica adventitia.
- זהה תכונות GCA, הכוללות חדירת לימפוציטים ומקרופאגים/היסטיוציטים, היפרפלזיה תאית ופירוק למינה אלסטית פנימית.
- לנתח את חדירת הלימפוהיסטיוציטים על ידי זיהוי וכימות מספר המקרופאגים ביחס ללימפוציטים. להעריך את מידת הפרעה למינה אלסטית פנימית ושינויים היפרפלסטיים בתאים תושבים ולהשוות אותם עם בקרות.
- לקטעים המוכתמים של IHC
- לבחון את דפוס הצביעה של FRB, תוך שימת לב לביטויו על ידי סוג מסוים או סוגי תאים ותפוצתו בתוך שכבות כלי הדם והקשר שלו לחדירה החיסונית הכוללת, סמן המקרופאגים הכולל, אנטי CD68, וסמן הלימפוציטים פאן אנטי CD3.
- כמת את הביטוי של תאי FRB, CD68 ו- CD3 על ידי ספירת התאים המוכתמים באופן חיובי ב- 10 שדות מרובים שנבחרו באופן אקראי בעוצמה גבוהה (HPF) ורשום את האמצעים.
הערה: זיהוי התאים והמבנים הנורמליים והפתולוגיים הללו בוצע על ידי פתולוג וראומטולוג קרדיווסקולרי מוסמך, והתוצאות נרשמו בכל המקרים.
- צלם תמונות מייצגות באמצעות מצלמה דיגיטלית.
הערה: לאחר שלבים אלה, aliquots הנותרים עשויים להיות מאוחסנים ב -80 °C.