$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הביקורת הווטרינרית JoVE.
1. קצירת רקמות וקרוסלינקינג UV
- יש להרדים 2 עכברים בוגרים באמצעות פחמן דו-חמצני (CO2) למשך 1-2 דקות או עד להפסקת הנשימה. לאחר מכן, בצע נקע צוואר הרחם על כל עכבר.
- קצרו כ-100 מ"ג אשכים מעכברים בגיל המתאים (אשך בוגר אחד במחקר זה) עבור כל ניסוי של משקעים חיסוניים, והכניסו את הרקמות למלח חוצץ פוספט קר כקרח (PBS).
- מוציאים את הטוניקה אלבוגיניאה בעדינות עם זוג פינצטה דקה.
- הוסף 3 מ"ל של PBS קר כקרח במטחנת רקמות וטריטורציה של הרקמה על ידי כוח מכני מתון באמצעות מזיק זכוכית רופף (סוג A זכוכית pestle).
הערה: מטרת שלב זה אינה לפרק תאים, אלא לפרק את הרקמה. שמירה על כדאיות התא ושלמותו חשובה.
- מעבירים את תרחיף הרקמה לצלחת תרבית תאים (בקוטר 10 ס"מ) ומוסיפים PBS קר כקרח עד 6 מ"ל.
- נערו את הצלחת במהירות, כך שהנוזל יכסה את תחתית המנה באופן שווה. אם הרקמה נטחנת כראוי, ניתן יהיה לראות צינוריות זרע מפוזרות באופן שווה, בעוד שנוכחות גושי רקמה מעידה על כך שפיזור הרקמה אינו אופטימלי.
- הצליבו את המתלים שלוש פעמים עם 400 mJ/cm2 ב-254 ננומטר על קרח. יש לערבב את התרחיף בין כל הקרנה.
הערה: עבור כל ניסוי חדש, crosslinking צריך להיות אופטימלי.
- אסוף את המתלה בצינור חרוטי 15 מ"ל וגלולה ב 1,200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של PBS, ולאחר מכן להעביר את המתלה לצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. יש לסחור בטמפרטורה של 4°C ו-1,000 x g למשך 2 דקות, ולהסיר את הסופר-נטנט.
- בשלב זה, מיד להמשיך עם שאר הפרוטוקול, או להקפיא את הכדוריות בחנקן נוזלי ולאחסן אותם ב -80 ° C עד לשימוש.
2. הכנת חרוזים
- הוסף 125 מיקרוליטר חלבון חרוזים מגנטיים לדגימה (כדור) לצינור צנטריפוגה טרי.
הערה: השתמש חרוזים מגנטיים חלבון G עבור נוגדנים עכבר.
- הניחו את הצינור על המגנט כדי להפריד את החרוזים מהתמיסה. לאחר 10 שניות, להסיר את supernatant. לשטוף חרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ ליזה קר כקרח.
הערה: הפרדה עוקבת של חלבון חרוזים מגנטיים A עוקבת אחר שלב זה. הרכב חיץ ליזיס הוא 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 100 mM NaCl; 1% NP-40; 0.1% SDS; 0.5% נתרן deoxycholate; 1/50 קוקטייל מעכבי פרוטאז ללא חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA) (להוסיף טרי).
- יש להשהות חרוזים ב-100 מיקרוליטר של חיץ ליזה קר עם נוגדן eCLIP של 10 מיקרוגרם. סובב צינורות בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות
הערה: ריכוז הנוגדנים הסופי עבור משקעים חיסוניים הוא 10 מיקרוגרם / מ"ל. אם ריכוז הנוגדנים אינו ידוע, יש למטב את כמות הנוגדנים.
- יש לשטוף חרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ ליזה קר כקרח.
3. ליזה רקמתית ועיכול RNA חלקי
- כדורי רקמה להשהות ב 1 מ"ל של חיץ ליזה קר (להוסיף 22 μL של 50x (EDTA) ללא קוקטייל מעכב חלבון ו 11 μL של מעכב RNase ל 1 מ"ל של חיץ ליזיס).
- השהיה מחדש של שני כדורי UV-crosslinked ושני כדורים שאינם מוצלבים לכל קבוצת ניסויים: כדורי UV-crosslinked-1 עבור ספריית eCLIP (UV-1); כדורי UV-crosslinked-2 עבור ספריית eCLIP (UV-2); כדורי non-crosslinked-1 עבור ספריית eCLIP כבקרה (לא UV); כדורי non-crosslinked-2 עבור IgG IP כדי להדגים את הספציפיות של נוגדנים.
הערה: הבקרה האידיאלית עבור ספריית eCLIP של האשכים הרחבים מסוג UV-crosslinked היא זו של אשכי נוקאאוט UV-crosslinked מעכברים של אותה המלטה.
- המשיכו להניח את הדגימות על קרח במשך 15 דקות (כדי למנוע התפרקות של חלבון ורנ"א).
- סוניק בסוניקטור דיגיטלי באמפליטודה של 10% למשך 5 דקות, ב-30 שניות על / 30 שניות כבוי. הניחו תמיד את הדגימה על קרח ונקו את הגשושית במים נטולי נוקלאז בין כל דגימה.
- הוסף 4 μL של DNase לכל צינור, וערבב היטב. יש לדגור במשך 10 דקות ב-37°C, תוך רעידות ב-1,200 סל"ד.
- מוסיפים 10 μL של RNase I מדולל (4 U/μL RNase I ב-PBS), ומערבבים היטב. יש לדגור במשך 5 דקות ב-37°C, תוך רעידות ב-1,200 סל"ד.
- נקה את הליזט באמצעות צנטריפוגה במהירות של 15,000 x גרם למשך 20 דקות (ב- 4 ° C).
- בזהירות לאסוף את supernatant. השאירו 50 μL של ליזט והשליכו את הגלולה איתו.
- שמור דגימות קלט כ- RWB (הפעל עבור כתם מערבי) ו- RRI (הפעל עבור בידוד RNA). שמור 20 μL (2%) של דגימות UV-1, UV-2, non-UV ו- IgG כתשומות להעמסת ג'ל RWB. שמור 20 μL (2%) של דגימות UV-1 או UV-2 כתשומות להעמסת ג'ל RRI.
4. משקעים חיסוניים
- הוסף 1 מ"ל של הליזט (משלב 3.7) לחרוזים (מוכן בסעיף 2) וסובב את הדגימות ב 4 ° C במשך 2 שעות או לילה.
- אספו את החרוזים עם מעמד מגנטי והשליכו את הסופרנטנט. שטפו את החרוזים פעמיים עם 900 μL של חיץ מלח גבוה (50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 M NaCl; 1 mM EDTA; 1% NP-40; 0.1% SDS; 0.5% נתרן deoxycholate), ולאחר מכן שטפו חרוזים פעמיים עם 900 μL של חיץ כביסה (20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 10 mM MgCl2; 0.2% Tween-20).
הערה: עבור מדגם IgG, השהה את ההליך כאן ואחסן אותו על קרח במאגר שטיפה.