בדיקה לניתוח מחזור התא של תאי T CD8+ ספציפיים לאנטיגן

תקציר

מקור: Simonetti, S., et al. A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen specific CD8 T cells in in vaccineated mice. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים בדיקה לניתוח תאי CD8⁺ T ספציפיים לאנטיגן בשלבי מחזור תאים שונים. תאים ברי קיימא בעלי תווית פלואורסצנטית נבחרים באמצעות ציטומטריית זרימה, והתאים בשלבי מחזור התא השונים מזוהים על ידי תכולת הדנ"א שלהם באמצעות נוגדנים כנגד חלבון גרעיני הקשור להתרבות תאים וכתם חומצת גרעין.

פרוטוקול

1. הכנת תמיסה בינונית ומכתימה

1. הכינו מדיום מלא: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) בינוני עם 2 mM גלוטמין, 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, 50 μM בטא-מרקפטואתנול, ו-10% נפח/נפח (v/v) של סרום בקר עוברי (FBS)
2. הכינו מאגר צביעה: מלח חוצץ פוספט ללא Ca²⁺/Mg²⁺ (PBS) עם 1% משקל/נפח (w/v) אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-2 mM מלח דיסודיום של חומצה אתילאנדיאמין-טטראצטית (EDTA)

2. טיפול בעכבר

1. פריים בן 7-8 שבועות, נקבת עכברי Balb/c על ידי הזרקה תוך שרירית (i.m.) בארבע ראשי של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-1-gag-expressing-chimpanzee adenoviral vector (ChAd3-gag) עם מינון של 10⁷ חלקיקים נגיפיים.
2. ב 1-4 חודשים לאחר ההקדמה, להגביר פעם אחת את העכברים על ידי הזרקת i.m. של HIV-1-gag-gag-ביטוי שונה חיסון אנקרה וירוס אנקרה (MVA-gag) עם מינון של 10⁶ יחידות יוצרות פלאק.
3. ביום השלישי שלאחר הדחיפה, הקריבו את העכברים המחוזקים על ידי פריקת צוואר הרחם, ונתחו אותם במקביל לעכברים שלא טופלו.
4. קצרו את בלוטות הלימפה (LNs) המנקזות את הארבע ראשי (iliac, popliteal, ו inguinal) ואת הטחול מעכברים מוגברת ולא מטופלים. יתר על כן, אספו את מח העצם (BM) משתי הרגליים האחוריות מעכברים שלא טופלו, והשתמשו ב-BM הזה להגדרות ציטומטר זרימה וכבקרה חיובית לניתוח מחזור התא (איור 1).
   הערה: צור וקטורים ChAd3-gag ו- MVA-gag כפי שתואר קודם לכן.

3. בידוד של LN ניקוז, טחול

1. בידוד תאי טחול ותאי LN
   1. מניחים 5 מ"ל של תווך שלם בכל אחד משני צינורות 15 מ"ל, ושומרים אותם על קרח, מוכנים לאיסוף איברים.
   2. להקריב עכבר בוגר על ידי נקע צוואר הרחם.
   3. הניחו את העכבר על גבו ועקרו את פני העור באתנול 70% v/v.
   4. כדי לאסוף LN מפשעתי, לבצע חתך אורך ~ 1 ס"מ על הבטן עם מספריים, ולמתוח את החתך עם המלקחיים.
   5. דמיינו LN מפשעתי על פני השטח הפנימיים של העור, וקצרו אותם עם המלקחיים. הניחו את ה-LN המפשעתי באחד משני צינורות 15 מ"ל שהוכנו בשלב 3.1.1.
   6. כדי לאסוף את הטחול, לבצע חתך הצפק עם מספריים ולהסיר את הטחול. לאחר חיתוך רקמת החיבור שמסביב, הניחו את הטחול לתוך הצינור השני של 15 מ"ל שהוכן בשלב 3.1.1.
   7. כדי לאסוף LN iliac, להזיז את המעיים הצידה לדמיין LN iliac קרוב הווריד נבוב נחות, ולאחר מכן לאסוף אותם באמצעות מלקחיים. הניחו את ה-LN האיליאק באותו צינור המכיל את ה-LNs המפשעתיים.
      הערה: כדי להשיג מספיק תאי LN לצביעה (ראה סעיף 4), לעתים קרובות יש צורך לאגור LN פופליטלי, מפשעתי ואיליאק מעכבר אחד. כל ה-LNs האלה מנקזים את הארבע ראשי (אתר החיסון). פרוטוקול זה משתמש רק בצינור אחד של 15 מ"ל של LN מאוגמים.
   8. כדי לאסוף LN popliteal, לתפוס את העור של הרגליים האחוריות בעדינות למשוך אותו כלפי מטה כדי לחשוף את השרירים. לאחר מכן, הכנס את המלקחיים בין השרירים מתחת למפרק הברך, ואסף את LN popliteal. מקם את LN popliteal באותו צינור המכיל LN מפשעתי ואיליאק.
      הערה: ראה הערה לאחר 3.1.7.
   9. מניחים את הטחול במסננת תאים של 70 מיקרומטר בתוך צלחת תרבית של 60 מ"מ מלאה ב-5 מ"ל של תווך שלם. באמצעות מזרק 5 מ"ל, בעדינות למעוך את האיבר עד disaggregation לחלוטין שלה.
   10. הסר את המסננת, ולהעביר את מתלה התא לצינור נקי 15 מ"ל.
   11. הוסף 5 מ"ל של מדיום מלא לצלחת התרבית, ובזהירות לשטוף את הכלים ואת המסננת כדי להבטיח כי כל התאים התאוששו. בריכה עם שאר תרחיף תא הטחול לתוך צינור 15 מ"ל.
   12. עבור LN מפשעתי, איליאק ופופליטלי מאוגמים, הכינו תרחיף חד-תאי לאחר הליך דומה לזה המשמש בשלבים 3.1.9 עד 3.1.11 עבור הטחול.
   13. תאי צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant ו resuspend את כדורי התא PBS.
   14. ספרו את התאים עם תא נויבאואר באמצעות חיץ ליזה של תאי דם אדומים ו-0.04% v/v טריפאן כחול ב-PBS.

4. צביעת טחול, LN

1. חלקו דגימות תאים שיוכתמו ל-3 תת-קבוצות: דגימות תאים לפיצוי, כולל תאי BM מעכברים לא מטופלים שיוכתמו רק ב-Hoechst 33342 (להלן Hoechst), ותאי טחול מעכברים לא מטופלים שישמשו להכנת תערובת תאים מתים/חיים לפיצוי צביעת תאים מתים; בקרה חיובית לניתוח מחזור התא, המורכבת מדגם BM מעכברים לא מטופלים; ודגימות ניסיוניות המכילות דגימות טחול ו-LN מעכברים לא מטופלים ומחוסנים.
   הערה: ודא שיש מספיק תאי טחול ו- LN לניתוח של מספר מספיק של תאי CD8 T ספציפיים לגאג. לעתים קרובות יש צורך להשתמש בתאי טחול מאוגמים ובתאי LN מאוגמים מ -3 עכברים מחוסנים ולהכתים שתי דגימות זהות או יותר של תאים מאוגמים, שכל אחד מהם מכיל 3 × 10⁶ תאים. מיזוג דגימות זהות בשלב צביעת Hoechst. באופן דומה, מכתימים תאי טחול ותאי LN מ-3 עכברים שלא טופלו, וממזגים דגימות זהות בסוף. הניחו בצד דגימה לא מוכתמת של תאי טחול מעכבר לא מטופל שתשמש להתקנת מכשירים ופיצוי.
2. הכינו תערובת תאים מתים/חיים לפיצוי צבע תאים מתים (תערובת תאים זו תוכתם רק בצבע התא המת).
   1. מחממים אמבט מים ב 65 °C (65 °F).
   2. קח aliquot של תאי הטחול (~ 3 × 10⁶).
   3. מעבירים את תרחיף התא לצינור מיקרופוגה, מניחים אותו באמבט המים ב 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן מיד מניחים אותו על קרח למשך 10 דקות.
   4. מערבבים את התאים המתים בחום עם תאי טחול חיים (~ 3 × 10⁶) ביחס של 1:1, ומעבירים מחצית מהתערובת לצלחת תחתונה עגולה היטב 96 (~ 3 × 10⁶ תאים / באר לבקרת צביעת התאים המתים).
3. צביעת תאים מתים של דגימות ניסיוניות, בקרה חיובית לניתוח מחזור התא, ותערובת תאים מתים/חיים
   1. מעבירים טחול, LN, תאי BM (3 × 10⁶ תאים/באר), ואת תערובת התאים המתים/חיים (סעיף 4.2) לצלחת עגולה בעלת 96 בארות, בהתאם לסכמת הצביעה (שלב 4.1), וצנטריפוגה ב-400 × גרם למשך 3 דקות ב-4°C.
   2. יש להשהות מחדש כל כדורית תא ב-50 מיקרוליטר של צבע תאים מתים המדולל ב-PBS, ולהשהות מחדש על ידי צנרת למעלה ולמטה 3 פעמים באופן מיידי.
   3. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C, מוגן מפני אור.
   4. לשטוף תאים 2 פעמים עם חיץ צביעה; בפעם הראשונה עם 200 μL ובפעם השנייה עם 250 μL. עבור כל צנטריפוגה לשטוף את הצלחת ב 400 × גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C.
   5. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את גלולת התא ב-20 מיקרוליטר של PBS.
4. צביעת תאי ממברנה עם קומפלקס היסטותאימות עיקרי (MHC)-מולטימרים פפטידים ונוגדנים חד שבטיים (mAbs).
   1. אם ניקח בחשבון את הכרכים הדרושים על פי ערכת הצביעה (הגדרות ציטומטר זרימה, טבלה 1), להכין את המגיבים הבאים:
      1. לדלל mAb 2.4G2 במאגר הצביעה בהתאם לדילול המתאים (ראה טבלת חומרים); עבור כל דגימה להיות מוכתם, להשתמש 10 μL של דילול זה.
         הערה: 2.4G2 mAb חוסם קשירה לא ספציפית לאנטיגן של אימונוגלובולינים לקולטני FcγIII ו-FcγII.
      2. יש לדלל את הטטרמר H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC) המסומן כטטרמר (Tetr-gag) במאגר הצביעה כדי לקבל את הדילול המתאים (ראה טבלת חומרים); כדי שכל דגימה תהיה מוכתמת, השתמש ב- 20 μL של דילול זה.
      3. הכינו את תערובת הנוגדנים על ידי דילול mAbs במאגר הצביעה בהתאם לדילול המתאים (ראו טבלת חומרים) שנקבע בעבר בניסויי טיטרציה; כדי שכל דגימה תהיה מוכתמת, השתמשו ב-20 μL של תערובת נוגדנים זו.
         הערה: כאן נעשה שימוש בחלבון אנטי-CD3e פרידינין כלורופיל (PerCP-Cy5.5) (שיבוט 145-2C11), אנטי-CD8a אולטרה סגול מבריק (BUV805) (שיבוט 53-6.7), ואנטי-CD62L פיקואריתרין ציאנין7 (PECy7) (שיבוט MEL-14).
   2. הוסף 10 μL של 2.4G2 mAb מדולל בעבר (שלב 4.4.1.1), ודגר במשך 10 דקות ב 4 °C, מוגן מפני אור.
   3. הוסף 20 μL של נגמ"ש Tetr-gag מדולל בעבר (שלב 4.4.1.2) ו- 10 μL של H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrin (PE) pentamer (pent-gag). יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C, מוגן מפני אור.
   4. הוסף 20 μL של תערובת נוגדנים שהוכנה בעבר (שלב 4.4.1.3), ודגרה במשך 15 דקות ב 4 ° C, מוגן מפני אור.
      הערה: לפיכך, הנפח הסופי הוא 80 μL לכל באר (שלב 4.3.5, שלבים 4.4.2 עד 4.4.4).
   5. לשטוף תאים עם 200 μL של חיץ צביעה. צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).
   6. השהה מחדש את גלולת התא ב 250 מיקרוליטר של חיץ צביעה, ולהעביר את תרחיף התא לצינורות 5 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של חיץ צביעה לצינור, וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   7. קח את aliquot של תאי BM (3 × 10⁶ תאים) (ראה רשימה של דגימות תאים, סעיף 4.1) כדי לשמש כדי לפצות את ערוץ Hoechst (Hoechst 33342 מעורר על ידי לייזר אולטרה סגול (הגדרות ציטומטר זרימה (טבלה 2)), ולהעביר את תרחיף התא לתוך צינור 5 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של חיץ צביעה לצינור, וצנטריפוגה 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.

5. קיבוע/חלחול

1. הכינו חיץ קיבוע/חדירה טרי על ידי דילול חלק אחד של תרכיז קיבוע/חדירה עם 3 חלקים של מדלל קיבוע/חדירה, בהתאם להוראות היצרן.
2. השליכו את מערבולת הסופרנאטנט והדופק את הדגימות כדי לפרק לחלוטין את הכדורית.
3. הוסף 1 מ"ל של חיץ הקיבוע/חלחול הטרי שהוכן לכל צינור, כולל צינור עם תאי טחול לא מוכתמים (3 x 10⁶, ראה רשימת דגימות תאים, סעיף 4.1), ומערבולת.
4. יש לדגור במשך 16 שעות בטמפרטורה של 4°C.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

6. צביעה תוך תאית

1. צביעת Ki67
   1. הכן חיץ חדירה טרי 1x על ידי דילול חיץ חדירה 10x עם מים מזוקקים, על פי הוראות היצרן. לפני השימוש, יש לסנן את מאגר החדירות 1x דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר כדי לסלק אגרגטים.
   2. דילול mAb Ki67 fluorescein isothiocyanate (FITC) (שיבוט SolA15) במאגר permeabilization 1x (ראה טבלת חומרים), כפי שנקבע בעבר בניסויי טיטרציה (נפח סופי של 100 μL לדגימה).
   3. הוסף 3 מ"ל של חיץ חדירה 1x לכל צינור, וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   4. השליכו את הסופרנאטנט וחזרו על שלב 6.1.3.
   5. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר של mAb Ki67 FITC מדולל בעבר (שלב 6.1.2).
   6. יש לדגור במשך 30 דקות ב-RT, מוגן מאור.
   7. לשטוף תאים 2 פעמים עם 4 מ"ל של חיץ permeabilization 1x. עבור כל צנטריפוגה לשטוף ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב RT.
   8. השהה מחדש את גלולת התא ב- PBS בהתחשב בנפחים הבאים: 350 μL של PBS עבור הדגימות שיש להשיג ישירות בציטומטר הזרימה; 250 μL של PBS עבור הדגימות להיות מודגר עם Hoechst זמן קצר לפני ציטומטריית זרימה (סעיף 6.2).
2. מכתים DNA
   1. הוסף 250 μL של 4 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst ב-PBS לכל דגימה (הריכוז הסופי של Hoechst הוא 2 מיקרוגרם/מ"ל).
      הערה: במקרה שהוכנו שתי דגימות זהות או יותר של 250 מיקרוליטר ב-PBS, מזג אותן בשלב זה, והוסף נפח שווה של 4 מיקרוגרם/מ"ל תמיסת Hoechst ב-PBS (הריכוז הסופי של Hoechst הוא 2 מיקרוגרם/מ"ל). מספר התאים משפיע מאוד על שלב צביעת הדנ"א. השתמש באותו מספר תא בכל דגימה. שימו לב שאפילו ירידה קלה במספר התאים (למשל, עקב אובדן תאים בשלבי שטיפה קודמים) גורמת להיקשרות גבוהה יותר של Hoechst לדנ"א ולעוצמת Hoechst גבוהה יותר.
   2. יש לדגור במשך 15 דקות ב-RT, מוגן מאור.
   3. צנטריפוגה את הדגימות ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב RT.
   4. להשעות מחדש את גלולת התא ב 350 μL של PBS.

7. הכנת דגימות חרוזי פיצוי

1. הכינו 5 μL של הנוגדן על ידי דילול mAb במאגר הצביעה כראוי.
   הערה: עבור כל mAb מצומד פלואורוכרום המשמש בניסוי, להכין את דגימת חרוז הפיצוי המתאים שלה.
2. Vortex Negative Control ו-Anti-Rat/Hamster Ig,κ Comp חרוזים לפני השימוש.
3. עבור כל דגימה, הציגו טיפה אחת (~ 20 μL) של Negative Control CompBeads וטיפה אחת של Anti-Rat/Hamster Ig,k CompBeads.
4. הוסף 5 μL של הנוגדן המדולל מראש (שלב 7.1) לצינור, וצינור למעלה ולמטה.
5. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C, מוגן מפני אור.
6. לשטוף דוגמאות עם 2 מ"ל של חיץ צביעה. צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).
7. השליכו את הסופרנטנט, והשהו מחדש את הגלולה על ידי הוספת 500 מיקרוליטר PBS לכל צינור ומערבולת.

8. הגדרת מכשיר ופיצוי ורכישת דגימה ניסיונית בציטומטר הזרימה

הערה: עיין בהגדרות ציטומטר זרימה (טבלה 2) עבור תצורת הציטומטר.

1. מכשיר כללי ומערך פיצוי
   1. פתח את התוכנה לרכישה לדוגמה (ראה טבלת חומרים) וצור ניסוי חדש על-ידי לחיצה על ניסוי חדש במקטע רצועת הכלים של סביבת העבודה ובחירה באפשרות ניסוי ריק חדש.
   2. לחץ פעמיים על הניסוי שנוצר כדי לפתוח אותו.
   3. בחלון הגדרות ציטומטר, לחץ על פרמטרים ובחר את כל הערוצים (למשל, PE, APC וכו ') המשמשים בלוח הצביעה, כולל פרמטרים פיזור קדימה (FSC) ופיזור צד (SSC).
   4. בחר קנה מידה ליניארי כפרמטר Hoechst על-ידי ביטול הסימון של קנה המידה של יומן הרישום ובדוק את הרוחב (W) של פעימת המתח עבור FCS, SSC ו- Hoechst.
      הערה: כל הפרמטרים מוצגים כברירת מחדל בקנה מידה לוגריתמי (יומן), למעט FSC ו- SSC הנמצאים בקנה מידה ליניארי. כל הפרמטרים מנותחים על ידי השטח (A) והגובה (H) של דופק המתח.
   5. בגליון העבודה הכללי, צור תרשים נקודה עם FSC-A בציר x ו- SSC-A בציר y.
   6. הפעל את דוגמת הטחול הלא מוכתמת על-ידי לחיצה על רכוש נתונים בלוח המחוונים של הרכישה.
   7. הגדר את הגדרות FSC ו- SSC המתאימות כדי להציג באופן חזותי את התאים על-ידי שינוי ערכי המתח במקטע פרמטרים, וצור שער לבחירת כל התאים המוצגים בתרשים הנקודות FSC-A/SSC-A על-ידי לחיצה על שער מצולע בסרגל הכלים של סביבת העבודה של גליון העבודה הכללי.
   8. הצג את התאים המגודרים בהיסטוגרמות עם כל פרמטר פלואורסצנטי על ציר x.
   9. הפעל דגימות טחול לא מוכתמות ומוכתמות במלואן כדי להתאים את גלאי הפלואורסצנטיות (PMT) כך שתהיה הפרדה ברורה בין אותות שליליים וחיוביים של התאים המוכתמים עבור כל פרמטר פלואורסצנטי.
   10. כדי לבצע הגדרת פיצוי, לחץ על ניסוי ברצועת הכלים של סביבת העבודה, ותחת המקטע הגדרת פיצוי, בחר צור פקדי פיצוי. בטל את הסימון כלול צינור בקרה לא מוכתם/באר ולחץ על OK.
       הערה: פעולה זו תגרום ליצירת דגימה בשם פקדי פיצוי וגליון עבודה רגיל המכיל מספר גליונות המתאימים לכל פרמטר שנבחר.
   11. הפעל דוגמה של חרוזי פיצוי (ראה סעיף 6); הגדר את הגדרות FSC ו- SSC המתאימות כדי להציג באופן חזותי את החרוזים על-ידי שינוי ערכי המתח וסף הרכישה של 5,000 בפרמטרים של FSC בחלון ציטומטר.
   12. התאימו את שער P1 על אוכלוסיית החרוזים, ובדקו שהשיאים החיוביים והשליליים נראים שניהם על ציר ה-x. חזור על פעולה זו עבור כל דגימת חרוזי פיצוי, ולבסוף תעד כל קובץ לדוגמה על-ידי לחיצה על רשום נתונים בלוח המחוונים של הרכישה (רשום לפחות 5,000 אירועים עבור כל מדגם).
   13. עבור כל דגימת חרוזים מתועדת, הגדר את שערי P2 ו- P3 על הפסגות החיוביות והשליליות, בהתאמה.
   14. הפעל את דגימות התאים לצורך פיצוי (ראה שלבים 4.2 ו- 4.4.7 וסעיפים 5 ו- 6). שנה את מתחי FSC ו- SSC ואת ערך הסף כדי להמחיש את התאים, להתאים את שער P1 ולבסוף להקליט כל קובץ לדוגמה (להקליט לפחות 10,000 אירועים). הגדר את שערי P2 ו- P3 על הפסגות החיוביות והשליליות, בהתאמה.
       הערה: לפיצוי ערוץ Hoechst, השתמש ב- G₀/G₁ כשיא השלילי (P3) וב- G₂/M כשיא החיובי (P2).
   15. לחץ על ניסוי במקטע רצועת הכלים של סביבת העבודה ובמקטע הגדרת פיצוי, בחר חשב פיצוי.
   16. תן שם להגדרת הפיצוי שנוצרה, קשר ושמור אותה בניסוי הנוכחי.
2. רכישת מדגם ניסיוני
   1. פתח דגימה על-ידי לחיצה על New Specimen בסרגל הכלים של הדפדפן וצור את אסטרטגיית gating בגליון העבודה הכללי.
      הערה: אסטרטגיית ה-gating של רכישת הדגימות דומה לזו של ניתוח הדגימה, המתוארת באיור 2 ובקטע 9.
   2. הצג את כל אוכלוסיות האירועים בהיסטוגרמה עם CD3-A על ציר ה- x. צור שער מרווח כדי לבחור רק את תאי CD3⁺ .
   3. בלוח המחוונים של הרכישה, בחר שער אחסון ככל האירועים עבור דגימות LN, ותאי All Events או CD3⁺ עבור דגימות טחול.
   4. הפעל את דגימות הניסוי במהירות נמוכה, ולבסוף תעד את כל הקבצים תוך הקפדה לאסוף לפחות 100-200 תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן עבור כל דגימה מהעכברים המחוסנים.
      הערה: גודל הקובץ של דגימות ניסיוניות הוא בדרך כלל גדול (30-120 MB), במיוחד כאשר התדירות של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן נמוכה. לפיכך, יש לאסוף מספר גבוה של אירועים (> 1 × 10⁶) כדי להקליט לפחות 100-200 תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן. קבצים גדולים עשויים להאט את תהליך ניתוח הנתונים הבא. רכישת תאי CD3⁺ בלבד בדגימות טחול (ראה שלב 8.2.2 לעיל) מועילה לשמור על גודל הקובץ קטן יותר.
   5. הפעל ורשום את הבקרה החיובית לניתוח מחזור התא, כלומר, דגימת BM מעכברים שלא טופלו.

9. ניתוח נתונים

1. פתח את התוכנה (ראה טבלת חומרים) וצור קבוצות שונות המתאימות לאיברים השונים שיש לנתח על-ידי לחיצה על צור קבוצה במקטע רצועת הכלים של סביבת העבודה (כלומר, צור קבוצה "a-LNs"; "b-spleen"; "c-BM").
   הערה: קבוצות חדשות שנוצרו יופיעו ברשימת הקבוצות, בעוד שקבוצת "פיצוי" תיווצר באופן אוטומטי על ידי התוכנה.
2. פתח את החלון שינוי קבוצה על-ידי לחיצה כפולה על שם הקבוצה ובדוק שהקבוצות החדשות שנוצרו מסונכרנות. אם לא, הוסף סימן ביקורת על הפונקציה Synchronized.
3. גרור כל קובץ .fcs בקבוצה המתאימה לו.
4. צור את אסטרטגיית gating החל מקבוצת "a-LNs".
5. לחצו פעמיים על הדגימה המוכתמת במלואה בקבוצה כדי לפתוח את חלון התרשים; ציר x וציר y מסומנים כמו בקובצי fcs (ראו הגדרות ציטומטר זרימה, טבלה 2).
6. הצג את סך האירועים שהתקבלו עבור דגימה זו בתרשים נקודה עם DNA-A על ציר x ו- DNA-W על ציר y.
7. בחרו רק באוכלוסיית התא הבודד בלחיצה על Rectangle באזור כלי ה-gating בחלון התרשים.
   הערה: לתאים בודדים יש ערכי DNA-A כדלקמן: 2N (נמוך): בין 2N ל-4N (ביניים), או שווה ל-4N (גבוה), בעוד שערכי DNA-W זהים לכולם (שלב 1 באיור 2).
8. לחץ פעמיים במרכז השער המלבני כדי להציג תאים בודדים בתרשים נקודות עם הפרמטר FSC-A על ציר x וצבע תאים מתים על ציר y.
9. בחרו רק באוכלוסיית התאים החיים בלחיצה על 'מצולע' באזור כלי ה-gating בחלון התרשים. תאים חיים הם שליליים עבור צבע התא המת (שלב 2 באיור 2).
10. לחץ פעמיים במרכז השער המצולע כדי להציג את התאים בתרשים נקודה עם הפרמטר FSC-A על ציר x והפרמטר SSC-A על ציר y.
11. לחצו על מלבן וצרו שער "רגוע" שיכלול את כל התאים החיים הבודדים בגרף הזה (שלב 3 באיור 2).
12. לחץ פעמיים במרכז השער "רגוע" כדי להציג את התאים בתרשים נקודה עם CD3 על ציר x ו- CD8 על ציר y.
13. בחר את תאי CD3⁺CD8⁺ על-ידי לחיצה על מצולע (שלב 4 באיור 2).
14. לחץ פעמיים במרכז השער CD3⁺CD8⁺ כדי להציג את התאים בתרשים נקודה עם Tetr-gag על ציר x ו- Pent-gag על ציר y.
15. בחר את תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן (חיוביים הן עבור Tetr-gag והן עבור Pent-gag) על-ידי לחיצה על Polygon (שלב 5 באיור 2).
16. לחצו לחיצה כפולה במרכז השער הספציפי לגאג כדי להציג את התאים בתרשים נקודה עם DNA-A על ציר ה-x ו-Ki67 על ציר ה-y (איור 3).
17. בחר את התאים בשלבי מחזור התא השונים על ידי לחיצה על Quad באזור כלי gating בחלון הגרף.
    הערה: תאים בשלב G₀ הם תאים נמוכים Ki67neg-DNA (הרביע השמאלי התחתון); תאים ב-G₁ הם Ki67pos-DNA נמוך (רביע שמאלי עליון); תאים ב-S-G2/M הם Ki67pos-DNA ביניים/גבוה (הרביע הימני העליון) (איור 3).
18. העתק את אסטרטגיית gating שנוצרה במדגם אחד לקבוצה המתאימה כדי להחיל את השערים על כל הדגימות של הקבוצה.
19. חזור על שלבים 9.5 עד 9.18 עבור "קבוצת a-LN".
20. בדקו שכל השערים מתאימים לכל דגימה מקבוצת "טחול B". כדי לנתח את מחזור התא בין תאי BM (בקרה חיובית), לחץ במרכז השער ה"רגוע" כדי להציג את התאים בתרשים נקודה עם DNA-A על ציר ה-x ו-Ki67 על ציר ה-y.
21. בדוק שכל השערים מתאימים לכל דגימה של 3 הקבוצות (כלומר, לתאים מטחול, LN ו- BM).
    הערה: שער אוכלוסיית תא בודד (שלב 9.7) ושער מרובע למחזור התא (שלב 9.17) עשויים להיות קואורדינטות שער שונות בדגימות שונות, בעיקר בשל הבדלים קלים אפשריים של עוצמת הצבע Hoechst בין דגימות (סעיף 6.2). מסיבה זו, ייתכן שיהיה צורך לשנות את שער האוכלוסייה של תא בודד ואת השער המרובע עבור מחזור התא בכל דגימה. פעולה זו תיעשה באופן הבא: לחץ פעמיים על שם הקבוצה והסר את הסנכרון ממאפייני הקבוצה. פעולה זו מאפשרת לשנות את השערים במדגם אחד מבלי לשנות את אותם שערים בכל שאר הדגימות של הקבוצה. לאחר הסרת הסנכרון, שנה את השערים במידת הצורך.
22. כדי להמחיש את התוצאות המתקבלות מניתוח זה, לחץ על עורך הפריסה במקטע רצועת הכלים של סביבת העבודה כדי לפתוח אותו. גרור כל שער של אסטרטגיית gating בחלונית לדוגמה לעורך הפריסה, והצב את התרשימים בהתאם לרצף אסטרטגיית הגאט. במקרה הצורך, שנו את סוג התרשים בלחיצה כפולה על התוויית התרשים המתאימה בפריסה ובחירת הסוג המתאים בחלון 'הגדרת תרשים'.
23. לחץ על הקבוצה וחזור על ידי פונקציות ברצועת הכלים של הפריסה כדי לדמיין את התוצאות המתקבלות בכל איבר, ולהשוות דוגמאות שונות.

טבלה 1: הגדרות ציטומטר זרימה.

לדוגמה	פאנל נוגדנים
מוכתם מלא	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5	נגמ"ש טטר-גאג	FVD eFluor 780	הוכסט 33342	CD8 BUV805	פנט-גאג PE
Ki67 FMO		CD3 PercpCy5.5	נגמ"ש טטר-גאג	FVD eFluor 780	הוכסט 33342	CD8 BUV805	פנט-גאג PE
טטר-גאג נגמ"ש FMO	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5		FVD eFluor 780	הוכסט 33342	CD8 BUV805	פנט-גאג PE
Pent-gag PE FMO	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5	נגמ"ש טטר-גאג	FVD eFluor 780	הוכסט 33342	CD8 BUV805
CD8 FMO	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5	נגמ"ש טטר-גאג	FVD eFluor 780	הוכסט 33342		פנט-גאג PE
CD3 FMO	Ki67 FITC		נגמ"ש טטר-גאג	FVD eFluor 780	הוכסט 33342	CD8 BUV805	פנט-גאג PE
כדאיות ניתנת לתיקון צבע FMO	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5	נגמ"ש טטר-גאג		הוכסט 33342	CD8 BUV805	פנט-גאג PE
הוכסט 33342 FMO	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5	נגמ"ש טטר-גאג	FVD eFluor 780		CD8 BUV805	פנט-גאג PE

טבלה 2: הגדרות ציטומטר זרימה.

כלי	BD LSR Fortessa
לייזר	כחול 488nm		אדום 639nm		UV 355nm		צהוב/ירוק 561nm
מסנני Bandpass	530/30	710/50	670/14	780/60	530/30	820/60	585/15	780/60
מסנני מעבר ארוך	505LP	685LP		750LP	505LP	770LP		750LP
פלואורוכרומים/צבע בשימוש	FITC	PERCPCY5.5	נגמ"ש	eFluor 780	הוכסט 33342	BUV805	PE	צרפת
שם מתאים בקבצי fcs	אלקסה פלור 488	PERCPCY5.5	נגמ"ש	APC-H7	Hoechst-Red	BUV737	PE	צרפת

תוצאות

איור 1: ניתוח מחזור תאים של תאי BM. תאי BM מעכברי Balb/c שלא טופלו הוכתמו ונותחו על ידי ציטומטריית זרימה. (A) דוגמה לאסטרטגיית gating. גידרנו על תאים בודדים בחלקת הדנ"א-A/-W (משמאל) ולאחר מכן על תאים חיים על ידי הוצאת צבע תאים מתים (באמצע). לאחר מכן, נעשה שימוש בשער FSC-A/SSC-A "רגוע" עבור כל תאי BM (מימין). (B) דוגמה לניתוח מחזור תאים של תאי BM (משמאל). השתמשנו בשילוב של Ki67 וצביעת דנ"א כדי לזהות ת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1-200 μL אוניברסלי מתאים בתפזורת קצוות פיפט ארוזים בתפזורת	קורנינג	CLS4866-1000EA
2.4G2 נגד FcγR mAb	ב.ד.	553141	ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל
5 מ"ל מזרק בוכנה	BD אמרלד	307733
15 מ"ל צינורות חרוטיים	מרק מיליפור	SBHA025SB
צלחת תרבית תאים 60 מ"מ מטופלת TC	בז	353002
מסננת תאים 70 מיקרומטר	בז	352097
96-באר תחתית עגולה שקופה מטופלת TC תרבית Microplate	בז	353077
חלקיקי פיצוי נגד חולדה/אוגר Ig,k/בקרה שלילית	BD- מדעי החיים	552845
בטא-מרקפטואתנול	סיגמא	M3148
אלבומין בסרום בקר	סיגמא	A07030
BUV805 עכבר נגד עכבר CD8a	BD- מדעי החיים	564920	ריכוז סופי של 4 מק"ג/מ"ל
מאגר פוספט מלח של Dulbecco עם סידן עם מגנזיום	יורושיבוט	ECB4004L
צינורות Eppendorf לנעילה בטוחה, 1.5 מ"ל	אפנדורף	30120159
אתנול	סיגמא	34852-1L-M
Ethylenediaminetetraacetic חומצה דיסודיום תמיסת מלח (EDTA)	סיגמא	E7889
סרום בקר עוברי	קורנינג	35-079-CV
פילקון, סטרילי, סוג מזרק 70 מיקרומטר	בז	352350
כדאיות ניתנת לתיקון צבע eFluor 780	eBioscience	65-0865-14	ריכוז סופי 1:1000
Foxp3 / ערכת חיץ צביעת גורם שעתוק	eBioscience	00-5523-00	ערכה זו מכילה ריכוז ודילול קיבוע/חדירות, ומאגר חדירות 10x
H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-שכותרתו טטרמר	מסופק על ידי NIH Tetramer Core Facility		ריכוז סופי של 6 מק"ג/מ"ל
H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrine (PE) מסומן pentamer	פרואימוניות	F176-2A-E - 176	10 μL / מדגם
Hoechst 33342, טריהידרוכלוריד, טריהידראט - 10 מ"ג/מ"ל תמיסה במים	תרמופישר	H3570
נוגדן חד שבטי Ki-67 (SolA15), FITC	eBioscience	11-5698-82	5 מק"ג/מ"ל ריכוז סופי
L-גלוטמין 100X (200 מילימול)	יורושיבוט	ECB3000D
מסנני Millex-HA 0,45 מיקרומטר	ב.ד.	340606
פניצילין/סטרפטומיצין 100X	יורושיבוט	ECB3001D
PE/ציאנין7 נוגדן CD62L נגד עכבר	ביואגדה	104418	ריכוז סופי של 0.2 מק"ג/מ"ל
PerCP-Cy™5.5 אוגר נגד עכבר CD3e	BD- מדעי החיים	551163	ריכוז סופי של 4.4 מק"ג/מ"ל
מאגר ליזה של תאי דם אדומים	סיגמא	₪1957
צינורות פוליסטירן בעלי תחתית עגולה, 5 מ"ל	בז	352058
RPMI 1640 בינוני ללא L-גלוטמין עם פנול אדום	יורושיבוט	ECB9006L
חבילת תוכנה לניתוח נתוני ציטומטריה של זרימה	פלוג'ו	פס' 10
תוכנה לרכישת דוגמאות ב flowcytometer	BD FACSDiva	גרסה 6.2
פתרון כחול טריפאן	יורושיבוט	ECM0990D