$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת חומרים להזרקה
- לעקר מחט 33 גרם מזרק: לפרק autoclave ב 115 οC. להכין מחטים להזרקה על ידי עלייה במי מלח סטריליים פוספט חוצץ (PBS).
- הפשירו חלקיקים המסומנים באופן פלואורסצנטי בטמפרטורת החדר למשך 5 - 10 דקות. הכינו את תמיסת החלקיקים להזרקה על ידי הרכבה מחדש לתמיסה של 50 מ"ג/מ"ל ב-PBS סטרילי עם יון סידן ויון מגנזיום (Ca2+/Mg2+).
הערה: חלקיקים מסומנים AF488 ממקור פטרייתי שאומתו עבור בדיקות phagocytosis משמשים בפרוטוקול זה. לספיגה מיטבית, יש להכין חלקיקים טריים ומיד לפני ההזרקה.
הערה 2: ריכוזי חלקיקים עשויים להיות אופטימליים עבור כל ניסוי ספציפי.
2. הזרקה תוך ויטריאלית של תמיסת חרוזים
הערה: שני אנשים נדרשים לבצע את ההזרקה, באופן כזה שהאדם המבצע את ההזרקה יכול להחזיק את העכבר ולשמור על המיקוד בגלגל העין, בעוד האדם השני מעביר את המזרק הטעון ודוחף את הבוכנה.
- מרדימים את המכרסם על ידי הזרקה תוך צפקית של 100 מ"ג/מ"ל קטמין ו-10 מ"ג/מ"ל קסילזין במינון של 20 מיקרוליטר/10 גרם משקל גוף. לפני ההזרקה, השתמש צביטת בוהן כדי להעריך את רמת ההרדמה.
הערה: Isoflurane יש השפעה עמוקה על תפקוד התא מיאלואיד, ולכן, השימוש בו לאורך כל הבדיקה הזאת יש להימנע.
- טען את המחט עם 0.5 μl של תמיסת חלקיקים מסומנת פלואורסצנטית.
- הניחו את העכבר הצידה מתחת למיקרוסקופ כירורגי (איור 1A-B). השתמש בחומר רך, למשל, חבילת ג'ל, למיקום טוב יותר של העכבר. עבור עכברים צעירים בהם העיניים עדיין לא פקוחות, פתחו בעדינות את העפעפיים בעזרת מלקחיים זוויתיים עדינים של 45מעלות על ידי יצירת סדק לאורך החריץ שממנו העפעפיים ייפתחו בסופו של דבר.
- בעזרת מלקחיים זוויתיים עדינים 45o בזהירות להפעיל לחץ סביב העפעף, כך גלגל העין בולט מעט מתוך השקע. החזיקו את הראש בשתי אצבעות ממש מעל האוזן ובלסת ומתחו בעדינות את העור במקביל לעפעפיים כדי להרחיק מעט את העין מהשקע. היזהרו לא לתפוס קרוב מדי לגרון (איור 1B).
- כדי לנקב את גלגל העין, הכנס את מחט המזרק ללימבוס הקרנית (היכן שהקרנית ולובן העין מתחברים). זה נראה כמו עיגול אפור בעכברים פיגמנטים. משכו מעט את המחט כדי להוציא נפח קטן של נוזל הזגוגית ואז הזריקו אותה. האדם המבצע את ההזרקה צריך להחזיק בעדינות את העכבר ביד אחת ואת המחט ביד השנייה; האדם השני צריך לדחוף לאט את הבוכנה.
- משכו את המזרק באיטיות. יש למרוח טיפות לחות לעיניים כדי לשמור על לחות העיניים.
- תנו למכרסם להתאושש בכלוב מעל כרית חום והמשיכו לעקוב אחר החיה. אם אתם עובדים עם גורים, אל תחזירו את בעל החיים לכלוב עם בעלי חיים ערניים אחרים עד שהוא נושם ומסוגל לתנועה ספונטנית. אם אתם עובדים עם מבוגרים, אל תחזירו את המכרסם לכלוב עם בעלי חיים ערניים אחרים עד שהוא יחזור לעצם החזה.
3. קצירת רקמת רשתית
הערה: יש לאסוף רקמת רשתית מעיניים שלא הוזרקו להן חלקיקים בעלי תווית פלואורסצנטית כבקרה לניתוח ציטומטרי של זרימה. למרות שניתן לבצע את הבדיקה באמצעות רשתית יחידה, לקבלת הביצועים הטובים ביותר, יש לאגד שתי רשתיות יחד.
- לאסוף רקמת רשתית 3 שעות לאחר הזרקה intravitreal של חלקיקים מסומנים פלואורסצנטית.
הערה: בעוד שהזמן שלאחר הזרקת תמיסת החלקיקים עשוי להיות אופטימלי עבור כל ניסוי ספציפי, מצאנו כי 3 שעות לאחר ההזרקה, ניתן היה לראות ספיגת חלקיקים ברוב שכבות הרשתית (איור 1C-D).
- להקריב עכברים על ידי נקע צוואר הרחם.
- אספו את גלגלי העיניים על ידי לחיצה עדינה על העפעף בעזרת מלקחיים זוויתיים עדינים של 45מעלות כדי לתמוך בגלגל העין. מקם את המלקחיים מאחורי גלגל העין ומשוך.
- נתחו את הרשתית תחת מיקרוסקופ מנתח. מעבירים את גלגל העין לצלחת פטרי המכילה כמות קטנה של PBS עם Ca2+/Mg2+. באזור יבש של צלחת פטרי, לנקב את גלגל העין בלימבוס הקרנית עם קצה של מלקחיים עדינים.
- החזיקו את גלגל העין בעזרת מלקחיים זוויתיים עדינים של 45מעלות והשתמשו במספריים קפיציים כדי לחתוך סביב לימבוס הקרנית, עד שנחתך כמחצית מהיקף הלימבוס של הקרנית.
- החזיקו את גלגל העין עם המלקחיים הזוויתיים העדינים של 45מעלות והכניסו את גלגל העין ל-PBS. עם זוג שני של מלקחיים זוויתיים עדינים 45o קורעים את הקרנית ואת לובן העין. העדשה והרשתית ייצאו שלמות.
- יש להפריד בין העדשה לרשתית. אספו את הרשתית והעבירו אותה למבחנה פוליסטירן של 5.4 מ"ל המכילה 2 מ"ל PBS עם Ca2+/Mg2+.
4. הכנת תרחיף תא בודד
- הכן מתלים חד-תאיים באמצעות ערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות עם שינויים קלים בהוראות היצרן. בקצרה, triturate retinas על ידי pipeting למעלה ולמטה עם פיפטה P1000 וביצוע עיכול אנזימטי ב 37 oC מבלי לרעוד.
5. צביעת מתלים של תא בודד לאנליזה ציטומטרית של זרימה
יש - להשהות מחדש תאים ב-200 מיקרוליטר של חיץ צביעה (מלח חוצץ פוספט של דולבקו עם אלבומין בסרום בקר 0.2% (BSA) ו-0.09% נתרן אזיד) ולהעביר לצלחת U-bottom של 96 בארות. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 130 x גרם.
הערה: נתרן אזיד מזיק לאדם ולסביבה. יש להשתמש בציוד מגן אישי מתאים ולהשליך פסולת בהתאם לתקנות המקומיות.
- הפכו את הצלחת מעל כיור כדי להשליך את הסופרנטנט. כדי לחסום קולטני Fc, יש להשהות מחדש תאים ב-25 μl של חיץ כתמים המכיל 5 מיקרוגרם/מ"ל של נוגדן CD16/CD32 נגד עכבר לכל באר. דוגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 25 μl של מאגר צביעה המכיל 0.5 מיקרוגרם/מ"ל של Ly6C-APC-Cy7 נגד עכבר, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל של Ly6G-Pe-Cy7 נגד עכבר, ו-2.5 מיקרוגרם/מ"ל של CD11b-BV650 נגד עכבר. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 130 x גרם. להפוך את הצלחת כדי להשליך את supernatant. יש לשטוף על ידי השעיית תאים ב-200 מיקרוליטר של חיץ צביעה.
- צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-130 x גרם. יש להשהות מחדש ב-200 מיקרוליטר של חיץ כתמים המכיל 0.5 מיקרוגרם/מ"ל של פרופידיום יודיד (PI). מעבירים לצינורות מיקרוטיטר 1.2 מ"ל.
- יש לשטוף בארות עם 100 μl נוספים של חיץ צביעה המכיל 0.5 מיקרוגרם/מ"ל של PI ולצבור עם 200 μl הקודמים בצינורות microtiter 1.2 מ"ל. נפח כולל של 300 μl של תאים מוכתמים מתקבל.
6. אנליזה ציטומטרית של זרימה
- באמצעות שלושה לייזרים רגילים (לייזר סגול, כחול ואדום), הימנע מצבעי PE, PerCP-Cy5.5, BV510 ו- PI עקב זליגה משמעותית מחלקיקי AF488-פלואורסצנטיים בהירים במיוחד. השתמשו בלייזר רביעי (צהוב) כדי למטב את הבדיקה הזו, מאחר שהוא מאפשר שימוש בנוגדנים המסומנים ב-PE וב-PI (בערוץ mCherry במקום בערוץ PerCP-Cy5.5) (איור 2).
הערה: אם לייזר צהוב אינו זמין, השתמש בצבע להרחקת תאים מתים בערוץ אחר.
- שער על תאים שליליים של PI (PI-) כדי להוציא תאים מתים (איור 2B).
- לאחר ניכוי תאים מתים, שער על תאים חיוביים CD11b (CD11b+), זה יכלול את כל התאים המיאלואידים (איור 2C).
- בתוך אוכלוסיית CD11b+, שער על Ly6C-/Ly6G- כדי להוציא נויטרופילים (CD11b+/Ly6G+) ומונוציטים (CD11b+/Ly6C+; איור 2D). לאחר שימוש במיקרוגליה (כאן מוגדר CD11b+/Ly6C-/Ly6G- לשם הפשטות), שתי אוכלוסיות ברורות צריכות להיות גלויות; אחד שלילי ואחד חיובי עבור חלקיקים המסומנים פלואורסצנטית. תאים פגוציטיים קולטים חלקיקים, ולכן הם AF488+ (איור 2E).
הערה: ניתן גם לנתח אוכלוסיות חיוביות Ly6C או Ly6G חיוביות כדי למדוד ספיגת חלקיקים באמצעות גישת צביעה זו. אחוז תאי CD11b+ פגוציטיים נמצא בקורלציה טובה עם אחוז תאי מיקרוגליה פגוציטיים (איור 2F). עבור חוקרים ללא ניסיון בציטומטריית זרימה, ניתן לבצע ניתוח פשוט יותר עם צביעת CD11b בלבד, אם כי זה יכלול נויטרופילים ומונוציטים פגוציטים, כמו גם מיקרוגליה. בתוך אוכלוסייה זו CD11b+/Ly6C-/Ly6G, תאים אלה > 99% מיקרוגליה כפי שנשפט על ידי צביעה עם הסמנים F4/80 ו- CX3CR1; ניתן להוסיף סמנים אלה אך אינם נחוצים בידינו.
