$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
הערה: פרוטוקול זה נבדק על תאי דם היקפיים מבודדים טריים או קפואים ועל דם שלם.
1. צביעת תאים
הערה: בחירת זוגות פלואורוכרום כמעט ללא חפיפה ספקטרלית חשובה כדי להפחית את התפשטות הנתונים עקב הזליגה הגבוהה של פלואורוכרום בגלאי פלואורוכרום אחר. כדי להשיג זיהוי אופטימלי של כל תת-קבוצות התא, יש להשתמש בפלואורוכרום עם תפוקה קוונטית גבוהה כגון זוגות נוגדנים PE-BV421 ו- PE-APC.
- צביעת PBMC טרי וקפוא
- העבר 100 μL של PBMC (1 x 106 תאים) לצלחת V-bottom 96 באר.
הערה: ניתן להשתמש בכל מספר תאים נמוך מ- 1 x 106 עם תוצאות דומות.
- צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 3 דקות ב RT בזהירות לשאוף את supernatant מבלי להפריע את כדור התא. הוסיפו לכל באר 100 מיקרוליטר של מלח חוצץ פוספט (PBS) המכיל צבע חי/מת הניתן לתיקון המגיב עם אמין חופשי על חלבונים במשך 10 דקות כדי לסמן תאים מתים.
- הכינו לכל דגימה 30 μL של תערובת המכילה את כל הנוגדנים (anti-CD3. -CD56, TCRγδ בפלואורוכרום A, ואנטי-CD4, CD8, CD19, CD14 בפלואורוכרום B). ריכוזי הנוגדנים מצוינים בטבלה 1 ובטבלה 2. בשלב זה ניתן להוסיף נוגדנים טיטרטיים כנגד מולקולות מטרה שונות ובפלואורוכרומים שונים (למשל, טבלה 3).
הערה: ריכוז הנוגדנים יכול להשתנות בהתאם ליצרן ומספר הלוט. לכן, בדיקות ראשוניות צריך להיעשות כדי להשיג את האות האופטימלי. PBS, PBS/0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA), PBS/0.2% נתרן אזיד או PBS/0.5% BSA/0.1% נתרן אזיד שימשו עם תוצאות דומות לדילול נוגדנים. תאים יכולים גם להיות מוכתמים בנפחים שונים מ 30 μL כדי לשלב בקלות מתודולוגיה זו לתוך פרוטוקולי צביעה קיימים כבר.
- צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 3 דקות ב RT בזהירות לשאוף את supernatant מבלי להפריע את כדור התא. מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים לכל באר ומשהים בזהירות מבלי ליצור בועות. דגירה במשך 30 דקות ב- RT בחושך.
הערה: ניתן להכתים את הדגימות ב 4 ° C עם תוצאות דומות.
- הוסף 150 μL של חיץ צביעה וצנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 3 דקות ב RT בזהירות לשאוף את supernatant מבלי להפריע גלולה התא. להשעות מחדש את התאים ב 200 μL של PBS ולקבל נתונים על ציטומטר זרימה. אם נפחי הצביעה משתנים, יש לוודא דילול של לפחות פי 20 מתערובת הנוגדנים המקורית ששימשה לשטיפת עודפי הנוגדנים.
הערה: תאים מוכתמים יכולים להיות קבועים בתוך PBS/2% paraformaldehyde, נשמר במקרר ב 4 ° C במשך הלילה, ולאחר מכן נרכש על ציטומטר זרימה למחרת.
זהירות: Paraformaldehyde מזיק אם נבלע ויכול לגרום לגירוי בעור
2. טיטרציה נוגדנים
הערה: טיטרציה של נוגדנים היא השלב הקריטי ביותר להשגת נתונים באיכות גבוהה הניתנים לשחזור. טיטרציה של anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 ו- -TCR γδ עוקבת אחר ההליך הסטנדרטי שבו ריכוז הנוגדנים להפרדה אופטימלית בין פסגות חיוביות ושליליות נגזר על ידי מדד צביעה מקסימלי. יש לבחור דילולים בשיא או קרוב יותר לשיא בצד העולה של עקומת מדד הכתמים (איור 1A-C). הנוגדן נגד CD4 הוא titrated כדי למקם את שיא האוכלוסייה CD4 חיובי בין אוכלוסיות CD3 חיובי יחיד ו CD3 + / CD8 + תאי T, קרוב יותר CD3 אות חיובי יחיד כדי להבחין טוב יותר אוכלוסיות CD8dim (CD8 + γδ תאי T ותאי T NK). באותו קו, טיטרציה CD56 שואפת למקם תאי NK CD56+ בין אוכלוסיית CD3+ לבין אוכלוסיית CD3.
- עקומת אינדקס כתמים מקסימלית
הערה: טיטרציה של anti-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 ו- -TCR γδ עוקבת אחר ההליך הסטנדרטי שבו ריכוז הנוגדנים להפרדה אופטימלית בין פסגות חיוביות ושליליות נגזר על ידי עקומת מדד צביעה מקסימלית. אם מוסיפים נוגדנים נגד סמנים אחרים ללוח, גם הם צריכים להיות טיטרציה עם עקומת אינדקס צביעה מקסימלית.
- הכינו דילול נוגדנים פי 2 על ידי מילוי 10 בארות של צלחת 96 בארות עם 40 μL של חיץ צביעה. בבאר הראשונה, להגדיל את נפח הסופי ל 80 μL של חיץ מכתים ולהוסיף את נוגדן עניין בריכוז 4 פעמים הריכוז המוצע על ידי היצרן.
- מערבבים היטב ומעבירים 40 μL לבאר השנייה. מערבבים היטב וחוזרים על שלב זה עבור כל הבארות האחרות.
- יש להכתים 10 דגימות של PBMC או דם שלם ב-30 μL מתוך 10 דילולים שונים של נוגדנים פי 2 בהתאם לפרוטוקול שתואר קודם לכן.
- השיגו נתונים באמצעות ציטומטר זרימה והתוו את האות מכל דילול (איור 1A).
- שער על האוכלוסיות השליליות והחיוביות עבור כל ריכוז נוגדנים. הגדלת ריכוז הנוגדנים יכולה להוביל לרקע גבוה יותר. לכן, שנה את גודל השער השלילי בהתאם.
- עבור כל ריכוז נוגדנים, לחלץ מידע על החציון וסטיית התקן עבור עוצמת הפלואורסצנט של האוכלוסייה השלילית, ואת החציון עבור עוצמת הפלואורסצנט של האוכלוסייה החיובית. חשב עבור כל ריכוז נוגדנים את מדד הכתם באמצעות נוסחה זו: (העוצמה הפלואורסצנטית החציונית של האוכלוסייה החיובית – העוצמה הפלואורסצנטית החציונית של האוכלוסייה השלילית) ÷ (פי 2 סטיית תקן של עוצמת הפלואורסצנט של האוכלוסייה השלילית) (איור 1B).
- שרטט את מדד הכתם לעומת ריכוז הנוגדנים המתבטא כשבריר מדילול הנוגדנים (למשל, דילול 1:10 = 0.1), וזהה את ריכוז הנוגדן עם ערך אינדקס הכתם המרבי (איור 1C).
- אנטי-CD4 ו-CD56 נוגדנים טיטרציה
הערה: טיטרציה נוגדנים נגד CD4 ו- CD56 מסתמכת על הטיטרציה הקודמת של הסמנים האחרים בלוח שני פלואורוכרום. עבור נוגדן אנטי-CD4, הטיטרציה נועדה למקם את האות האנטי-CD4 בין האות הכפול CD8+/CD3+ לבין האוכלוסייה החיובית היחידה של CD3 (איור 1D).
- טיטרט את הנוגדנים נגד CD4 ו- CD56 עם אסטרטגיית דילול פי 2 כפי שתואר קודם, הוספת ריכוזים נוספים בין לבין כדי לזהות בעדינות את טווח הריכוז המאפשר להפריד תאי T CD4+ ותאי NK מאוכלוסיות התאים האחרות.
- בצע טיטרציה של הנוגדן נגד CD4 על-ידי מיקום האות האנטי-CD4 בין האות הכפול CD8+/CD3+ לבין האוכלוסייה החיובית היחידה של CD3 (איור 1D).
הערה: יש להקפיד במיוחד על הפרדה ברורה בין תאי CD4+ T לבין אוכלוסיות עמומות CD8+.
- טיטרט את הנוגדן נגד CD56 בעקבות אסטרטגיה דומה לטיטרציה נוגדנים נגד CD4, על ידי הצבת תאי NK בין האוכלוסייה CD3 שלילי לאוכלוסיות CD3 חיוביות.
3. אסטרטגיית גאטינג
- לזהות אוכלוסיות תאים לימפוציטיים ומונוציטיים ולהסיר תאים מתים ואת רוב תאי הדם האדומים שיורית מהניתוח.
- בחר את כל האוכלוסייה המכילה לימפוציטים ומונוציטים בהתבסס על אזור פיזור קדמי לעומת צד (FSC-A לעומת SSC-A). הסר צברי תאים מהניתוח באמצעות גובה פיזור קדימה לעומת רוחב פיזור קדימה (FSC-H מול FSC-W) וגובה פיזור צד לעומת רוחב פיזור צד (SSC-H לעומת SSC-W).
- השתמש בסמן אפליה חי/מת כדי להוציא תאים מתים חיוביים בהירים ותאי דם אדומים שיוריים מהניתוח. שער על לימפוציטים ומונוציטים המבוססים על פרופילי FSC-A ו- SSC-A השונים.
- אסטרטגיית gating דו-פלואורוכרום בעלת שבעה סמנים של אוכלוסיות הלימפוציטים.
הערה: בתוך תת-הקבוצה החיובית CD3, ניתן להפריד תאי T CD4+, CD8+ ו- γδ באמצעות נוגדנים המכוונים אך ורק ל- CD4, CD8 ולקולטן γδ. באופן דומה, בתוך תת-הקבוצה השלילית CD3, תאי B, תאי NK ומונוציטים יכולים להיות מזוהים באופן ייחודי באמצעות נוגדנים נגד CD19, CD56 ו- CD14, בהתאמה.
- בחרו את שער הלימפוציטים וצרו תרשים נקודות עם אחד משני פלואורוכרומאים שבכל ציר משתמשים בהם בפרוטוקול הזה (איור 2B).
- שער על תאי CD8+ T המזוהים כתאים חיוביים כפולים CD3+/CD8+ בפינה הימנית העליונה של תרשים הנקודות (איור 2B). אל תכלול את אוכלוסיית CD8 עמומה שעשויה להכיל תאי NKT. שער על תאי CD4+ T שזוהו כאוכלוסייה בין תאי T CD8+ לבין אוכלוסיות חיוביות בודדות CD3. שער על תאי γδ T המזוהים כתאי CD3 גבוהים. חלק תאי γδ T ל- CD8 חיובי ו- CD8 שלילי.
- שער על תאי NK המזוהים כאוכלוסייה בין תאים חיוביים ל- CD3 שליליים. חלק תאי NK ב- CD8 חיובי ו- CD8 שלילי. שער על תאי B שזוהו כאוכלוסיית CD19+ שלילית CD3 בפינה הימנית התחתונה של חלקת הנקודות.
- בחרו את שערי המונוציטים וצרו תרשים נקודות עם אחד משני פלואורוכרומים בכל ציר שמשמשים בפרוטוקול הזה (איור 2C). שער על אוכלוסיית CD3-/CD14+.
טבלה 1: לוח נוגדנים המשמש לצביעה של תאי חיסון דו-פלואורוכרום של PBMC (שילוב BV421-PE).
| יעד | שיבוט | פלואורוכרום | ספק | ריכוז | תכלית |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | ב.ד. | 1/20 | השושלת |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | ב.ד. | 1/900 | |
| TCRγδ | ב1 | BV421 | ביו | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | ב.ד. | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | ב.ד. | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | ב.ד. | 1/15 | |
| CD19 | היב19 | PE | ב.ד. | 1/300 | |
| תאים מתים | | L/D כחול | זה | 1/300 | אפליה חיה/מתה |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies |
טבלה 2: לוח נוגדנים המשמש לצביעה של תאי חיסון דו-פלואורוכרום של PBMC (שילוב APC-PE).
| יעד | שיבוט | פלואורוכרום | ספק | ריכוז | תכלית |
| CD3 | UCHT1 | נגמ"ש | ב.ד. | 1/20 | השושלת |
| CD56 | NCAM16.2 | נגמ"ש | ב.ד. | 1/60 | |
| TCRγδ | ב1 | נגמ"ש | ביו | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | ב.ד. | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | ב.ד. | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | ב.ד. | 1/15 | |
| CD19 | היב19 | PE | ב.ד. | 1/300 | |
| תאים מתים | | L/D כחול | זה | 1/300 | אפליה חיה/מתה |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies |
טבלה 3: לוח נוגדנים המשמש להכתמת PBMC קפוא מחולה עם מיאלומה נפוצה.
| יעד | שיבוט | פלואורוכרום | קטלוג | ספק | ריכוז | תכלית |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | 562426 | ב.ד. | 1/20 | השושלת |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | 562751 | ב.ד. | 1/900 | |
| TCRγδ | ב1 | BV421 | 331217 | ביו | 1/30 | |
| CD4 | RPA-T4 | PE | 555347 | ב.ד. | 1/450 | |
| CD8 | RPA-T8 | PE | 555367 | ב.ד. | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | 555398 | ב.ד. | 1/15 | |
| CD19 | היב19 | PE | 555413 | ב.ד. | 1/300 | |
| CCR7 | G043H7 | AF647 | 353217 | ביו | 1/30 | בידול |
| CD45RA | HI100 | APC-H7 | 560674 | ב.ד. | 1/60 | |
| CCR4 | 1G1 | PE-Cy7 | 561034 | ב.ד. | 1/60 | תת-קבוצות Th |
| CCR6 | G034-E3 | BV605 | 353419 | ביו | 1/30 | |
| CXCR3 | 1C6/CXCR3 | AF488 | 561730 | ב.ד. | 1/30 | |
| CD57 | NK-1 | PE-CF594 | 562488 | ב.ד. | 1/900 | הפעלה/תשישות |
| HLA-DR | G46-6 | BV510 | 563083 | ב.ד. | 1/30 | |
| CD16 | 3G8 | BUV395 | 563784 | ב.ד. | 1/30 | NK, הפעלת מונוציטים |
| תאים מתים | L/D כחול | L-23105 | זה | 1/300 | אפליה חיה/מתה |
