שימוש בבדיקות מתח מבוססות DNA כדי להעריך את כוחות הקולטן המופעלים על ידי תאי מערכת החיסון

תקציר

מקור: Ma, R. et al., DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells. J. Vis. Exp.(2021)

הסרטון מדגים שיטה להערכת כוחות קולטן המופעלים על ידי תאי מערכת החיסון באמצעות ננו-חלקיקי זהב מעוגני פוליאתילן גליקול ובדיקות מתח של סיכות שיער DNA. אינטראקציות תאי T חיוביים ל- CD8 מעוררות התפתחות בדיקה, פולטות פלואורסצנטיות בעוד שגדילי נעילה מקיימים את האות לכימות הכוחות המופעלים על ידי תאי מערכת החיסון.

פרוטוקול

1. הכנת אוליגונוקלאוטיד

1. ממיסים את גדיל הליגנד חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) במים (התנגדות של 18.2 MΩ, בשימוש לאורך כל הפרוטוקול). מערבלים ומסובבים את התמיסה עם צנטריפוגה שולחנית. כוונן את נפח המים כך שהריכוז הסופי הוא 1 mM. לאמת את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר ננו-טיפות כדי למדוד את הספיגה ב 260 ננומטר ולקבוע את הריכוז הסופי בהתבסס על מקדם ההכחדה של האוליגונוקלאוטידים.
   הערה: גדיל הליגנד עובר שינוי בכל טרמינוס, 5' אמין ו-3' ביוטין, כדי להצמיד את הפלואורופור ולהציג את הליגנד הביוטינילציה. קבוצת האמין בגדיל הליגנד צריכה להיות מצומדת עם פלואורופור. צבע Cy3B משמש לצמידות זו בשל בהירותו הגבוהה ויציבות האור, אך הוא אינו מוצע בדרך כלל באופן מסחרי ודורש צימוד פנימי. בהתאם לכך, החלק הבא מתאר את הצמידות בין אמינים לבין צבעי אסטר N-hydroxysuccinimide (NHS). עבור משתמשי קצה שאין להם גישה למתקנים או משאבים לשינוי חומצות גרעין, ניתן לרכוש במקום זאת חומצות גרעין שעברו שינוי מספקי סינתזת DNA מותאמים אישית המציעים צבעים בהירים וניתנים לצילום, כגון משפחת הצבעים Alexa ו-Atto.
2. הכינו 10x תמיסות מלח חוצצות פוספט (PBS) ו-1M נתרן ביקרבונט (NaHCO₃). יש לערבב 10 μL של תמיסת גדיל ליגנד אמין 1 mM (10 nmol) עם 10 μL של 10x PBS, 10 μL של 1 M NaHCO₃ ו-60 μL של H₂O. להמיס 50 מיקרוגרם של Cy3B N-hydroxysuccinimide (אסטר NHS) ב-10 μL של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) מיד לפני השימוש ולהוסיף לתערובת לקבלת נפח תגובה כולל של 100 μL. הוסף אסטר Cy3B NHS אחרון. יש לאפשר להגיב בטמפרטורת החדר למשך שעה או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
3. הכן את גדיל הנעילה Atto647N על ידי הצמדת גדיל נעילת האמין עם אסטר Atto647N NHS. הכן פתרון 10x PBS ו- 1 M NaHCO₃. יש לערבב 10 μL של תמיסת גדיל נעילת אמין 1 mM (10 nmol) עם 10 μL של 10x PBS, 10 μL של 1 M NaHCO₃ ו-60 μL של H₂O. יש להמיס 50 מיקרוגרם של Atto647N NHS ester ב-10 μL של DMSO מיד לפני השימוש ולהוסיף לתערובת לקבלת נפח תגובה כולל של 100 μL. הוסף Atto647N NHS ester אחרון. יש לאפשר להגיב בטמפרטורת החדר למשך שעה או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
4. לאחר התגובות, הסירו תוצרי לוואי, עודפי צבע ומלחים על ידי סינון ג'ל התפלה P2. לדלל את תערובת התגובה עם H₂O לנפח כולל של 300 μL, המתאים לשלב הטיהור הבא של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). הוסף 650 μL של ג'ל P2 לח להתקן צנטריפוגלי וסחרור כלפי מטה ב 18,000 x גרם במשך דקה אחת. הסר את הנוזל בתחתית המכשיר, הוסף את תערובת התגובה לעמודה המכילה ג'ל P2, סובב כלפי מטה ב- 18,000 x גרם למשך דקה אחת ואסוף את תערובת התגובה בתחתית המכשיר.
   הערה: ג'ל P2 צריך להיות hydrated לפחות 4 שעות לפני השימוש עם H₂O.
5. לטהר את תערובת התגובה המותפלת עם HPLC באמצעות עמודת C18 המיועדת לטיהור אוליגונוקלאוטידים, עם ממס A: 0.1 M triethylammonium אצטט (TEAA) ב- H₂O ו- B: acetonitrile (ACN) כשלב הנייד לפליטת שיפוע ליניארי 10-100% B במשך 50 דקות בקצב זרימה של 0.5 מ"ל לדקה. הזריקו את תערובת התגובה המותפלת ב- HPLC בשלב הפוך עם לולאת הזרקה של 500 μL לטיהור. אספו את המוצר שיש לו שיא ספיגה עבור חומצה דאוקסיריבונוקלאית, דנ"א (260 ננומטר), ושיא ספיגה עבור הפלואורופור (560 ננומטר עבור Cy3B ו-647 ננומטר עבור Atto647N) וייבשו אותם ברכז ואקום צנטריפוגלי למשך הלילה (ראו איור 1A).
6. הרכיבו מחדש את מוצר צבע האוליגו המיובש ב-100 מיקרוליטר מים. קבע את הריכוז של גדיל ליגנד Cy3B וגדיל נעילה Atto647N באמצעות ספקטרופוטומטר ננו-טיפות. ודא שיחס סימון הצבע קרוב ל-1:1. נכון לספיגה של 260 ננומטר של הצבע במידת הצורך בעת קביעת ריכוז האוליגונוקלאוטידים.
7. אמת את המוצר המטוהר עם זמן יינון יינון של ספקטרומטריית מסה בסיוע מטריצה בלייזר בסיוע מטריצה (MALDI-TOF-MS) באמצעות 3-הידרוקסיפרופיונאלדהיד (3-HPA) כמצע ב-50% ACN/H₂O עם 0.1% חומצה טריפלואורצטית (TFA) ו-5 מ"ג/מ"ל אמוניום ציטראט באמצעות 0.5 מיקרוליטר של המוצר ב-1-5 מיקרומטר להכנת דגימת MALDI-TOF-MS. ספקטרום מסה לדוגמה ניתן למצוא באיור 1B.
8. ממיסים את גדיל סיכת הראש ואת גדיל העוגן המרווה במים ומוודאים שריכוז תמיסות הציר הוא בין 50 ל-100 μM.
   הערה: גדיל סיכת הראש אינו משתנה וניתן לסנתז אותו ישירות בהתאמה אישית מספק. גדיל העוגן כולל קבוצת עיגון תיול ומרווה BHQ2 וניתן לסנתז אותו בהתאמה אישית ישירות מספק.
9. Aliquot כל האוליגונוקלאוטידים. לשימוש ואחסון לטווח קצר, אחסנו אוליגונוקלאוטידים אלה בטמפרטורה של 4°C. לאחסון לטווח ארוך, יש להקפיא ולשמור אותם בטמפרטורה של -20°C. בשלב זה, כל האוליגונוקלאוטידים מוכנים להרכבת בדיקת מתח DNA.
   הערה: מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים אינם בעייתיים עבור אוליגונוקלאוטידים.

2. הכנת פני השטח

הערה: הכנת מצעי בדיקת מתח סיכת שיער DNA אורכת יומיים. בדיקת המתח של סיכת השיער DNA תתפקד על כיסויי זכוכית.

1. יום 1
   1. הניחו את הכיסויים בקוטר 25 מ"מ על מדף פוליטטרה-פלואוראתילן בכד של 50 מ"ל. כל מדף יכול להכיל עד 8 כיסויים. שטפו את הכיסויים על ידי טבילתם במים שלוש פעמים.
   2. הוסיפו 40 מ"ל של תמיסת אתנול מעורבבת עם מים ביחס של 1:1 (v:v) לכד המכיל את המתלה והכיסויים, ואטמו את הכד באמצעות סרט פרפין.
   3. סוניק את הכד למשך 15 דקות בשואב על-קולי (תדר הפעלה 35 קילוהרץ) כדי לנקות את הכיסויים. לאחר הסוניקציה, יש להשליך את הנוזל ולשטוף את הכד עם המתלה ולכסות אותו במים לפחות 6 פעמים כדי להסיר את שאריות הממס האורגני.
   4. הכינו תמיסת פיראנה טרייה על ידי ערבוב חומצה גופרתית ומי חמצן ביחס של 3:1. כדי להפוך 40 מ"ל של תמיסת פיראנה, הוסף 30 מ"ל של חומצה גופרתית לכוס נקייה של 50 מ"ל תחילה ולאחר מכן הוסף לאט 10 מ"ל של מי חמצן, H₂O₂. תמיסת פיראנה תתחמם ותבעבע במהירות עם הוספת H₂O₂. מערבבים בעדינות את הפיראנה בעזרת קצה פיפטה מזכוכית.
   5. לאחר מכן, העבירו את המתלה שמחזיק את הכיסויים לכוס המכילה תמיסת פיראנה מעורבת בעדינות לחריטה (איור 2A). תנו לתמיסת פיראנה לעבור הידרוקסילאט ונקו את הכיסויים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חריטת פיראנה, מעבירים את המדף באמצעות פינצטה מפלדה או פוליטטרה-פלואוראתילן לכוס נקייה של 50 מ"ל במים ושוטפים שוב במים לפחות 6 פעמים.
      זהירות: כמויות גדולות של חומרים אורגניים עלולות להגיב במרץ עם תמיסת פיראנה ועלולות לגרום לפיצוץ. היזהר ותמיד עבוד עם פתרון פיראנה במכסה אדים. הקפידו ללבוש מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן. לעולם אל תאחסן תמיסת פיראנה טרייה במיכל אטום.
      הערה: יחס מי חמצן לחומצה גופרתית צריך להישמר מתחת ל-1:2 (v:v) ולעולם לא יעלה על 1:1. כאשר שוקעים את המדף עם כיסויים בתמיסת פיראנה, מניחים אותם בתמיסה לאט ובזהירות. אין להשליך את התמיסה מיד לאחר התחריט, מכיוון שהיא עדיין פעילה וחמה. השאירו אותו בכוס למשך הלילה לפני שאתם שופכים אותו למיכל הפסולת החומצית.
   6. טבלו את המתלה המחזיק את הכיסויים בכוס 50 מ"ל עם אתנול 40 מ"ל כדי להסיר מים. השליכו את האתנול וחזרו על הפעולה 3 פעמים כדי לוודא שהמים הוסרו.
   7. לאחר מכן טבלו את המדף ב-3% אמינופרופיל טריאתוקסי סילאן (APTES) (v/v) ב-40 מ"ל אתנול כדי להגיב עם ה-OH על הכיסויים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (איור 2B).
      הערה: אתנול יכול להיות מוחלף על ידי אצטון.
   8. יש לשטוף את המשטחים 6 פעמים על ידי טבילתם באתנול 40 מ"ל, ולאחר מכן לייבש בתנור בטמפרטורה של 80°C למשך 20 דקות. לאחר הקירור, אחסנו את הכיסויים המיובשים שעברו שינוי אמין בטמפרטורה של -20°C לשימוש עתידי (עד 6 חודשים).
   9. מכסים את הצד הפנימי התחתון של צלחות פטרי מפלסטיק בקוטר 10 ס"מ בסרט פרפין. סרט הפרפין מונע מהכיסויים להחליק בתוך צלחת הפטרי ועוזר לשמור על הפתרון לשלבים הבאים של תפקוד על הכיסויים. הניחו את כיסויי האמין המקוררים בצלחות הפטרי. הצד שיש לתפקד צריך להיות עם הפנים כלפי מעלה.
   10. כדי לשנות את קבוצות האמינים על תלושי הכיסוי, יש להוסיף 300 μL של 0.5% פולי חומצה ליפואית (אתילן גליקול) (PEG) NHS (LA-PEG-SC) ו-2.5% w/v mPEG NHS (mPEG-SC) ב-0.1 M NaHCO₃ על כל כיסוי, ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (איור 2C). עבור כל כיסוי בקוטר 25 מ"מ, יש לשקול 1.5 מ"ג LA-PEG-SC ו-7.5 מ"ג mPEG-SC. להמיס את ריאגנטים NHS מיד לפני הוספתם למשטחים, כפי שיש להם מחצית חיים קצרה (~ 10 דקות) בתמיסה מימית בטמפרטורת החדר. לאחר התגובה, יש לשטוף את המשטחים 3 פעמים במים.
       הערה: תגובת NHS יכולה להתבצע ב 4 ° C בן לילה. ריאגנטים NHS יש מחצית חיים ארוכה יותר לפני הידרוליזה ב 4 ° C, אשר סביב 4-6 שעות. התוצאה תהיה הליך הכנת משטח של שלושה ימים.
   11. הוסף 100 μL של 0.1 M סודיום ביקרבונט, NaHCO₃ המכיל 1 מ"ג / מ"ל של sulfo-NHS אצטט לקבוצה של כיסויי "כריך" (שני כיסויים פונים זה כלפי זה עם חיץ תגובה ביניהם). אפשר לפסיבציה להתרחש במשך 30 דקות לפחות. כדי לשמור את מגיב, שלב זה יכול להיעשות עם 50 μL של 1 מ"ג / מ"ל sulfo-NHS אצטט. יש לשטוף במים שלוש פעמים לאחר פסיבציה.
   12. הוסיפו 0.5 מ"ל של ננו-חלקיקי זהב (AuNP, 8.8 ננומטר, חומצה טאנית, 0.05 מ"ג/מ"ל) לכל כיסוי ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (איור 2D). כדי להציל את המגיב, שלב זה יכול להיעשות על ידי סנדוויץ' שני כיסויים גם כן. ודא שאין מלחים במערכת מהשלבים הקודמים כדי למנוע הצטברות של ננו-חלקיקי זהב. אין להשאיר את הכיסויים להתייבש לאחר שלב זה.
   13. בינתיים, טרום הכלאה של סיכת ראש 4.7 pN, גדיל ליגנד Cy3B וגדיל עוגן BHQ2 היוצרים את גשושיות מתח ה- DNA בונות ביחס של 1.1:1:1 ב- 1 M נתרן כלורי (NaCl) ב- 300 ננומטר בצינור תגובת שרשרת פולימראז (PCR). אנאל את הגדילים על ידי חימום התמיסה עד 95 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן בהדרגה לקרר על ידי הפחתת הטמפרטורה ל 20 ° C במשך 30 דקות במחזור תרמי.
   14. שטפו את הכיסויים במים שלוש פעמים לאחר 30 דקות דגירה עם ננו-חלקיקי זהב. הוסף גדיל עוגן BHQ2 נוסף (ממלאי של 100 מיקרומטר) לתמיסת ה- DNA המחושלת כדי להפוך את היחס בין גדיל העוגן BHQ2 לגדיל ליגנד Cy3B ביחס של 10:1. בשלב זה, תמיסת הדנ"א צריכה להכיל 300 ננומטר של מבנה בדיקת מתח וגדיל BHQ2 של 2.7 מיקרומטר. הוסיפו 100 מיקרוליטר לכל שני כיסויים כדי ליצור את ה"כריך" (איור 2E).
   15. מניחים בזהירות כדור רקמת מעבדה רטוב בצלחת הפטרי (הרחק מכיסויים) ואוטמים את הכלי בסרט פרפין כדי למנוע מהתמיסה להתייבש. מכסים את התבשיל בנייר כסף ודגרים ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
2. יום 2
   1. שטפו את הבדיקות העודפות מהכיסויים עם 1x PBS. בדוק את איכות פני השטח של בדיקת מתח DNA תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.
   2. הכינו 40 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטאווידין ב-PBS 1 ודגרו על כיסויים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (איור 2F). בדרך כלל, 100 μL מספיק עבור כיסוי 25 מ"מ. יש לשטוף עם PBS 3 פעמים לאחר הדגירה כדי לשטוף את הכמות העודפת של סטרפטווידין.
   3. הכינו 40 מיקרוגרם/מ"ל נוגדן/ליגנד ביוטינילציה ב-1x PBS. הוסיפו 50-100 מיקרוליטר לכריך ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (איור 2G). יש לשטוף עם PBS שלוש פעמים לאחר הדגירה כדי לשטוף את הכמות העודפת של נוגדן/ליגנד ביוטינילציה.
   4. הרכיבו בזהירות את תאי ההדמיה הנקיים עם המשטחים. משטחים יכולים להיסדק בקלות בעת הידוק החדרים. הוסיפו 0.5-1 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) לתאי ההדמיה ושמרו אותם מוכנים להדמיה עם תאים (איור 2H).

3. כוחות קולטן התא

1. הכינו תאי חיסון בעלי עניין בHBSS ב 1-2 x 10⁶ תאים/mL.
   הערה: תאים נאיביים OT-1 CD8+ משמשים כדוגמה במאמר זה. לטהר תאי T נאיביים OT-1 CD8⁺ מטחול של עכברים שהוקרבו באמצעות ערכת בידוד תאי CD8⁺ T של עכבר MACS עם מפריד מיון תאים מופעל מגנטית (MACS) בהתאם להוראות היצרן. בודדו והעשירו את תאי ה-T CD8⁺ על ידי הסרת תאי T שאינם CD8+ שקוקטייל נוגדנים מדלל-מגנטים קשור אליהם. יש להשהות מחדש תאי T נאיביים OT-1 CD8+ מטוהרים ב-HBSS ב-2 x 10⁶ תאים/מ"ל ולשמור על קרח לפני השימוש.
2. בדוק את איכות משטח בדיקת המתח של סיכת השיער של DNA תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (100x אובייקטיבי) לבקרת איכות לפני הוספת ליגנדות או תאי ציפוי. צלם וכמת את עוצמת הרקע הממוצעת בערוץ Cy3B של משטח בדיקת מתח של סיכת שיער DNA מלפחות 5 מיקומים שונים ו-3 עותקים משוכפלים. שמור על עקביות בתנאי רכישת ההדמיה כך שניתן יהיה להשתמש בערך זה כסמן אמין של איכות פני השטח וצפיפות הגשושית (איור 3C).
   הערה: כמת את מספר גדילי הדנ"א לכל ננו-חלקיק זהב ואת מספר חלקיקי הזהב למיקרומטר² בפעמים הראשונות של הכנת פני השטח על פי הספרות, אשר יכול לשמש סמן אמין נוסף של איכות פני השטח.
3. צלחת ~ 4 x 10⁴ - 10 x 10⁴ תאים על כל בדיקת מתח DNA מתפקדת כיסוי ולאפשר להם להתחבר ולהפיץ במשך ~ 15 דקות בטמפרטורת החדר.
4. כאשר תאים מצופים על גשושיות המתח של סיכות השיער של הדנ"א ומתחילים להתפשט, דמיינו את אותות הפלואורסצנטיות שנוצרים בערוץ Cy3B עם המטרה של 100x (איור 2I).
5. לאחר שתאים מתחילים להפיק אות מתח בזמן אמת על משטח בדיקת המתח של סיכת השיער של הדנ"א בערוץ Cy3B, רכשו תמונות הן בערוצי Cy3B והן בערוצי Atto647N (מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) נותן יחס אות לרעש טוב יותר מאשר אפיפלואורסצנציה). לאחר מכן, הוסף את גדיל Atto647N לתאי ההדמיה בריכוז סופי של 200 ננומטר לצורך הכלאה סלקטיבית מכנית.
6. לאחר 10 דקות של דגירה, הסירו במהירות ובעדינות את החיץ המכיל את גדיל הנעילה הפלואורסצנטי Atto647N והחליפו אותו במלחים מאוזנים טריים של האנק. תמונה בשני ערוצי Cy3B ו- Atto647N שוב ולקבוע את מקדם המתאם של פירסון עם תוכנת פיג'י.
7. בנקודת העניין של החקירה, הציגו גדיל נעילה שאינו פלואורסצנטי לתאים בתא ההדמיה כדי לאחסן את אות המתח. מכינים מלאי גדילי נעילה (100 מיקרומטר) ומוסיפים לתאים בריכוז סופי של 1 מיקרומטר. פיפטה עדינה לערבוב. משך הנעילה יכול להשתנות אך 10 דקות הוא הזמן המומלץ.
8. רכשו סרטים בהילוך מהיר או תמונות של נקודות קצה באפיפלואורסנציה הן למיפוי מתח איכותי והן לניתוח כמותי לפי הצורך (איור 2J ואיור 4).
   הערה: אם יש צורך במדידת מתח במספר נקודות זמן, יש להתחיל במחיקת אותות מתח מאוחסנים על ידי הוספת גדיל פתיחה. כדי להימנע משטיפה עודפת, ריכוז סופי גבוה יותר של גדיל הנעילה ב-2 מיקרומטר משמש כדי ליזום תגובת תזוזה בתיווך הגדיל בתיווך הבוהן עם גדיל הנעילה למשך 3 דקות, אשר מוחקת את האותות המאוחסנים (איור 2J). שטפו בעדינות את עודפי האוליגונוקלאוטידים עם HBSS. בדיקת המתח של סיכת השיער של הדנ"א עולה על פני השטח והתאים מוכנים לסבב נוסף של אחסון ומיפוי מתח. שחרור אותות מתח אינו הכרחי אם רק נקודת זמן אחת מעניינת במחקר.

תוצאות

איור 1: דוגמאות להכנת אוליגונוקלאוטידים.(A) כרומטוגרמה HPLC של טיהור גדילי ליגנד Cy3B; (ב) ספקטרום MALDI-TOF-MS של המוצר; (C) טבלה של המסה המחושבת ופסגות m/z שנמצאו של החומר המוצא והאוליגונוקלאוטיד המסומן.

איו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
3-חומצה הידרוקסיפיקולית (3-HPA)	סיגמא	56197	מטריצת Maldi-TOF-MS
mPEG-SC	ביוכימפג	MF001023-2K	הכנת משטח
(3-אמינופרופיל)טריאתוקסיסילן	אקרוס	AC430941000	הכנת משטח
10x חיץ ליזה של תאי דם אדומים	ביואגדה	00-4333-57	מאגר
ננו-חלקיקי זהב 8.8 ננומטר, חומצה טאנית	ננו-קומפוזיקס	הזמנה מותאמת אישית	הכנת משטח
Atto647N NHS אסטר	סיגמא	18373-1MG-F	פלואורופור, הכנת אוליגו
תא אטופלואור, למיקרוסקופ	תרמו פישר סיינטיפיק	A7816	דימות
מזרקי BD רק עם Luer-Lok	BD bioscience	309657	תאים
CD3e נגד עכבר Biotinylated	Ebioscience	13-0031-82	נוגדן/ליגנד
ביוטינילציה pMHC ovalbumin (SIINFEKL)	NIH Tetramer Core Facility באוניברסיטת אמורי	נה	נוגדן/ליגנד
אלבומין בסרום בקר	סיגמא	735078001	חסימת אינטראקציות לא ספציפיות
מסננות תאים	ביולוג'יקס	15-1100	תאים
מתלה מיני כיסוי, טפלון	תרמו פישר סיינטיפיק	C14784	הכנת משטח
אסטר Cy3B NHS	GE שירותי בריאות	PA63101	פלואורופור, הכנת אוליגו
מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS)	קורנינג	21-031-ס"מ	מאגר
אתנול	סיגמא	459836	הכנת משטח
המלחים המאוזנים של האנק (HBSS)	סיגמא	H8264	מאגר
מי חמצן	סיגמא	H1009	הכנת משטח
LA-PEG-SC	ביוכימפג	HE039023-3.4K	הכנת משטח
ערכת הפעלה Midi MACS (LS)	Miltenyi ביוטק	130-042-301	תאים
עכבר CD8+ T ערכת בידוד תאים	Miltenyi ביוטק	130-104-075	תאים
Nanosep MF התקנים צנטריפוגליים	מעבדת פאל	ODM02C35	הכנת אוליגו
כיסויי זכוכית עגולים מס' 2	VWR	48382-085	הכנת משטח
נת"ע-סם	Dojindo טכנולוגיות מולקולריות	N475-10	הכנת משטח
ג'ל P2	ביו-ראד	1504118	הכנת אוליגו
חומצה גופרתית	חברת EMD Millipore	SX1244-6	הכנת משטח
סולפו-NHS אצטט	תרמו פישר סיינטיפיק	26777	הכנת משטח
ציוד
Agilent AdvanceBio אוליגונוקלאוטיד C18 עמודה, 4.6 x 150 מ"מ, 2.7 מיקרומטר	653950-702		הכנת אוליגונוקלאוטיד
מערכת טיהור מים ננו-טהורים Barnstead	תרמו פישר		מים
המטרה של CFI Apo 100× NA 1.49	ניקון		מיקרוסקופ
קוביית Cy5	כרומה		מיקרוסקופ
התקן Evolve electron multiplying charge coupled (EMCCD)	פוטומטריה		מיקרוסקופ
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים	אג'ילנט 1100		הכנת אוליגונוקלאוטיד
מקור אפיפלואורסצנטי Intensilight	ניקון		מיקרוסקופ
ספקטרומטר מסה בסיוע לייזר בסיוע מטריצה (MALDI-TOF-MS)	וויאג'ר STR		הכנת אוליגונוקלאוטיד
ספקטרופוטומטר Nanodrop 2000 UV-Vis	תרמו פישר		הכנת אוליגונוקלאוטיד
Nikon Eclipse Ti מיקרוסקופ הפוך	ניקון		מיקרוסקופ
מערכת מיקוד מושלמת של Nikon	ניקון		מיקרוסקופ
ש"ח תוכנת אלמנטס	ניקון		מיקרוסקופ
קוביית TIRF 405/488/561/647 עם ארבעה פסים	כרומה		מיקרוסקופ
קוביית RICM	כרומה		מיקרוסקופ
משגר TIRF עם 488 ננומטר (50 mW), 561 ננומטר (50 mW) ו- 640 ננומטר	קוהרנטית		מיקרוסקופ
קוביית TRITC	כרומה		מיקרוסקופ
שם אוליגו	5' שינוי / 3' שינוי	רצף (5' עד 3')	שימוש
15mer אמין נעילת גדיל	5' שינוי: ללא שינוי 3' שינוי: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	נעילת אות מתח בזמן אמת
גדיל נעילה Atto647N 15mer	5' שינוי: Atto647N 3' שינוי: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	נעילת אות מתח בזמן אמת
גדיל נעילה לא פלואורסצנטי 15mer	5' שינוי: ללא שינוי 3' שינוי: ללא שינוי	A AAA AAC ATT TAT AC	נעילת אות מתח בזמן אמת לצורך ניתוח כמותי
קווצת סיכת ראש 4.7 pN	5' שינוי: ללא שינוי 3' שינוי: ללא שינוי	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC	בדיקת סיכת ראש
גדיל ליגנד אמין	5' שינוי: /5AmMC6/ 3' שינוי: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	בדיקת סיכת ראש
גדיל עוגן BHQ2	שינוי 5': /5ThiolMC6-D/ 3' שינוי: /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	בדיקת סיכת ראש
גדיל ליגנד Cy3B	שינוי 5': Cy3B 3' שינוי: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	בדיקת סיכת ראש
ביטול נעילה של גדיל	5' שינוי: ללא שינוי 3' שינוי: ללא שינוי	תג GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	שחרור אות מתח מצטבר

TA TA