כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת מניות CFSE ואחסון
- הכינו מלאי של 5 mM של 5 ו-6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) בדימתיל סולפוקסיד. מערבולת. יש להוציא אליציטוטים של 100 μl לתוך מיקרו-צינורות סטריליים של פקק בורג בנפח 0.5 מ"ל. יש לאחסן aliquots ב -80 °C.
2. עכברים
- השתמש עכברים זכרים או נקבות בין 8 ל 12 שבועות של גיל. בעלי חיים תואמי מין וגיל עדיפים. ודא שהאישורים האתיים הדרושים לבעלי חיים קיימים לפני תחילת הניסויים.
3. אימוביליזציה של בעלי חיים עם הרדמה בגז איזופלורן
- להעמיס את יחידת ההרדמה עם isoflurane. ממלאים את מזרק הזכוכית אטום לגז 10 מ"ל באיזופלורן. הימנעו מהחדרת בועות אוויר. חבר את המזרק ואת כניסת הנוזל עם הצינור שסופק והזז את הדוחף קדימה עד שהנוזל בצינור החיבור עומד להיכנס באופן גלוי למאדים.
הערה: אין לאחסן איזופלורן במזרק כאשר אינו בשימוש.
- מרדימים בעלי חיים עם איזופלורן בתא האינדוקציה, עם זרימת אוויר שנשמרת בערך 400 - 500 מ"ל לדקה וריכוז איזופלורן ב 3.5%.
הערה: היחידה לא תפעל ללא זרימת אוויר.
- לאחר שהחיות ישנו, סובבו את הסטופרקוק על יחידת ההרדמה כדי לנתב את גז האיזופלורן לחתיכת המסכה. בדקו שחתיכת המסכה שלמה כדי למנוע דליפת גז. זרימת האוויר יכולה להישמר ברמה של 400 מ"ל/דקה, או לחלופין לרדת ל-200 מ"ל/דקה. להפחית את ריכוז isoflurane ל 2.6%.
הערה: ניתן להגביר ו/או להקטין את אפקט ההרדמה על ידי התאמת קצב הזרימה.
4. זריקות BCG והתאוששות
- אשרו ויזואלית ובצעו בדיקות כגון בדיקת רפלקס צביטת הבוהן כדי לוודא שעכברים משותקים/ישנים על פיסת מסכת האיזופלורן לפני ביצוע הזרקות.
- יש לחסן בכרית כף הרגל האחורית, 1 x 106 יחידות יוצרות מושבה של Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) ב-30 μl של מלח חוצץ פוספט (PBS) באמצעות מזרק המצויד במחט בגודל 29 G x 1/2 אינץ'.
הערה: יצירת מלאי מיקובקטריאלי מתוארת בקצרה בתיאור המקורי של הליך זה, ובפירוט ניכר במקומות אחרים. BCG זמין גם ממקורות מסחריים. המחברים ממליצים כי BCG יופעל באמצעות פולס או יועבר דרך מזרק כדי לשבש גושים לפני חיסולו בעכברים. BCG חוזר כאן כגירוי מיקרוביאלי בהתחשב בשימוש בו בתיאור המקורי של פרוטוקול 3 זה, אך המחברים בהחלט מעודדים בדיקה של גירויים מיקרוביאליים אחרים.
- בצע את אותו הליך המתואר לעיל עבור הזרקת PBS לעכברי ביקורת.
- יש לעקוב אחר בעלי חיים לאחר ההזרקות כדי לוודא שההתאוששות מההרדמה מוצלחת ושבעלי חיים יכולים לתמוך בעצמם על כרית כף הרגל האחורית המוזרקת.
5. זריקות CFSE
- הכנת CFSE לזריקות
- הפשיר בקבוקון של 5 mM תמיסת מלאי CFSE מ -80 ° C. לדלל את CFSE פי 10 ב- PBS. יש להשהות את התמיסה ביסודיות לפני מילוי המזרק לקראת ההזרקה.
- הזרקה והתאוששות CFSE
- חזור על הליך הרדמת בעלי חיים בסעיף 3. יש להזריק 20 μl של 0.5 mM CFSE בכרית כף הרגל האחורית שקיבלה בעבר BCG או PBS.
הערה: הזרקת CFSE צריכה להתבצע יום לפני (24 שעות) התאריך המתוכנן להקרבה.
6. הסרה כירורגית של בלוטת הלימפה הפופליטלית (pLN)
הערה: מומלץ להשתמש בכלי ניתוח מעוקרים וטיהורם החוזר ונשנה באתנול 70% במהלך שלב זה.
- הרדימו את העכברים. רססו את בעל החיים באתנול 70%. הצמידו את בעל החיים למצב גבי, על לוח דיסקציה.
הערה: המחברים יכולים להמליץ על המתת חסד באמצעות פריקת צוואר הרחם.
- בזהירות לבצע חתך אנכי בירך האחורית. לנקות שריר ושומן באמצעות מספריים ופינצטה כדי לחשוף וכתוצאה מכך להסיר את pLN הממוקם עמוק בתוך שקיק השומן, בשקע של הברך.
- מעבירים את ה-pLN ל-PBS סטרילי בנפח 0.5 מ"ל, על קרח.
7. יצירת תרחיף חד-תאי מ-pLN
- הומוגניזציה של pLN באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרון הממוקמת בצלחת 6 בארות המכילה 5 מ"ל PBS או חיץ מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) (PBS המכיל 2% סרום עגל עוברי (FCS), 5 mM חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), ו 1 mM נתרן azide). הומוגניזציה דרך המסננת באמצעות הקצה האחורי של מזרק 3 מ"ל.
הערה: נתרן אזיד הוא רעיל ויש לטפל בו בזהירות.
- שטפו את המסננת עם עוד 5 מ"ל של חיץ PBS או FACS, אספו את החומר בצינור של 15 מ"ל, ושחררו את התאים ב 277 x g (1,200 סל"ד, R = 172 מ"מ) במשך 5 דקות, 4 ° C. לחלופין, הומוגניזציה pLN ישירות צינורות microcentrifuge באמצעות הומוגנייזרים פוליפרופילן.
- בהתבסס על גודל הכדור, השהה מחדש את מתלה ה- pLN בנפח מתאים של מאגר PBS או FACS, לדוגמה, 200 - 1,000 מיקרוליטר. השתמש בתא ספירה כדי לכמת את מספר התאים הכולל המתקבל מכל מתלה LN. השתמשו בכחול טריפאן כדי לא לכלול תאים מתים/גוססים.
8. צביעת תאים וציטומטריית זרימה
- העבר 1 - 10 x 106 תאים ל 5 מ"ל צינורות פוליסטירן עגול תחתית. יש לשטוף עם חיץ FACS וגלולה באמצעות צנטריפוגה במהירות של 277 x גרם (1,200 סל"ד, R = 172 מ"מ) למשך 5 דקות, 4°C.
- יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה בקוקטייל נוגדנים של 50 - 100 מיקרוליטר (ראו סמנים של תאים דנדריטיים [DC] המשמשים לצביעת פני השטח, טבלת חומרים) המכילים 0.5 - 1 מיקרוגרם CD16/CD32 נגד עכבר (כדי לחסום אינטראקציות לא ספציפיות בתיווך Fc) במאגר FACS למשך 30 - 45 דקות, על קרח. הגן על דגימות מפני אור.
- לאחר הדגירה, לשטוף תאים עם חיץ FACS גלולה על ידי צנטריפוגה ב 277 x גרם (1,200 סל"ד, R = 172 מ"מ) במשך 5 דקות, 4 ° C.
- תאי השעיה מחדש במאגר FACS של 50 - 100 מיקרוליטר. קבל נתונים על ציטומטר זרימה.
