כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. A. fumigatus תרבות ותנאים
- הכינו מדיום אגר מינימלי גלוקוז כמתואר.
- כוונן את המדיה ל- pH 6.5 באמצעות 1 M נתרן הידרוקסידי (NaOH) ו autoclave ב 120 ° C במשך 20 דקות.
- מניחים להתקרר ל-65°C.
- עובדים במכסה מנוע סטרילי, יוצקים 30 מ"ל של מדיה מקוררת לתוך בקבוק T75 ומאפשרים לו להתקרר כאשר צוואר הבקבוק מונח על פיפטה של 25 מ"ל ליצירת מדרון אגר.
- פזרו את זן dsRed Af293-Aspergillus fumigatus על האגר ודגרו במשך 7 ימים בטמפרטורה של 37°C + 5% פחמן דו-חמצני (CO2). שתי צלוחיות יניבו כ-109 קונידיה בפרה-ביוטינילציה של 5 מ"ל מלח חוצץ פוספט (PBS).
2. A. fumigatus תיוג והכנה
הערה: בעת ביצוע בדיקה זו בפעם הראשונה, הכן את זן ההורה Af293-A. fumigatus. יש לקחת דגימות של שני הזנים בצינורות מיקרוצנטריפוגות ולסמן רק אחד מכל זן כמתואר להלן. זה יאפשר לשלוט בקונידיה ללא צבע וקונידיה עם צבע יחיד, dsRed או Alexa Fluor 633 (AF633), כדי לבדוק את ההתקנה והציוד.
- קציר A. fumigatus conidia על ידי טבילת התרבות עם 30 מ"ל PBS + 0.05% Tween-80. סנן את המתלה שנוצר דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל כדי להסיר שברי hyphal.
- צנטריפוגה ב 805 x גרם במשך 10 דקות, להסיר את supernatant, ולשטוף פעם אחת ב 20 מ"ל של PBS סטרילי. בריכה conidia משתי צלחות של אותו זן במהלך שלב השטיפה.
- לאחר שלב השטיפה, להשעות מחדש את הגלולה ב 5 מ"ל של PBS ולהעביר 1 מ"ל aliquots של תרחיף conidial לתוך צינורות microcentrifuge. 1 מ"ל של תרחיף של כל זן מספיק בדרך כלל להדמיית תאים חיים. לעטוף את aliquots הנותרים בנייר כסף ולאחסן ב 4 °C.
- צנטריפוגה של מתלה קונידיאלי ב 9,300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בזהירות להסיר supernatant. להשעות מחדש את הגלולה conidial ב 1 מ"ל 0.05 M סודיום ביקרבונט (NaHCO3) pH 8.3.
- הכינו תמיסת מלאי של 10 מ"ג ביוטין/200 מיקרוליטר דימתיל סולפוקסיד (DMSO) על ידי הרכבה מחדש של 25 מ"ג ביוטין ב-500 מיקרוליטר DMSO. הוסף 10 μL ביוטין / DMSO תמיסת מלאי לצינור מיקרוצנטריפוגה, לכסות אותו ברדיד אלומיניום, ולדגור במשך 2 שעות על נדנדה ב 4 ° C.
- Aliquot את שארית תמיסת מלאי ביוטין / DMSO ולהקפיא ב -20 ° C לשימוש בניסויים הבאים.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 9,300 x גרם ובזהירות להסיר את supernatant. יש להשהות מחדש את הגלולה הקונידיאלית ב-1 מ"ל של 100 מ"ל Tris (hydroxymethyl) aminomethane-hydrochloride (Tris-HCl) pH 8.0 למשך שעה אחת כדי להשבית ביוטין צף חופשי.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 9,300 x גרם ובזהירות להסיר את supernatant. לשטוף את הגלולה פעמיים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי ולהשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של PBS.
- יש להמיס 1 מ"ג של Streptavidin-AF633 ב-0.5 מ"ל של PBS ליצירת תמיסת מלאי של 2 מ"ג/מ"ל. יש להוסיף 10 μL של 2 מ"ג/מ"ל סטרפטווידין-AF633 לכל 1 מ"ל של תרחיף קונידיאלי ולדגור במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר על נדנדה מכוסה ברדיד אלומיניום. את שאר Streptavidin-AF633 ניתן להקפיא ב aliquots לשימוש בניסויים הבאים.
- צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 9,300 x גרם ובזהירות להסיר supernatant. יש להשהות מחדש את הגלולה הקונידיאלית ב-1 מ"ל של PBS ולספור את הקונידיה באמצעות המוציטומטר בדילול של 1:1,000 (1:100 ולאחר מכן 1:10). כוונן את הריכוז הקונידאלי ל- 3.6 x 106/מ"ל עם מדיה בלתי תלויה ב- CO2, עטוף בנייר כסף ואחסן ב- 4 ° C.
הערה: הקונידיה מסומנת כעת ב-AF633 והיא תיקרא FLuorescent Aspergillus REporter (FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia.
- אופציונלי: אם נדרש גירוי עם קונידיה נפוחה, לאחר ספירת קונידיה (שלב 2.9), לדלל את הקונידיה ל 7.2 x 106/מ"ל בתווך בסיס חנקן שמרים (YNB) ולהוסיף 500 μL תרחיף קונידיאלי ל 4.5 מ"ל מדיום YNB בבקבוק Erlenmeyer 50 מ"ל אוטוקלאב. מכסים ומניחים את הבקבוק באינקובטור רועד (200 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס) במשך 6 שעות.
- מעבירים את המדיום לצינור של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 805 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף פעם אחת PBS. צנטריפוגה שוב וגלולה להשהות בתווך עצמאי 1 מ"ל CO2, נותן 3.6 x 106 conidia/mL.
הערה: קונידיה מתגבשת לעתים קרובות לאחר שהם נפוחים מה שמקשה על ספירה מדויקת, מומלץ לחשב עם המספרים הנספרים של קונידיה במנוחה בשימוש.
3. בידוד נויטרופילים ומונוציטים אנושיים
- יש לשאוב 20 מ"ל דם ורידי ממתנדבים בריאים לשני צינורות דם של 10 מ"ל המכילים חומצה אתילאנדיאמין-טטראצטית (EDTA). עבור כל תורם בנפרד, לשפוך 20 מ"ל דם לתוך צינור 50 מ"ל לדלל עם 15 מ"ל PBS.
- שכבת הדם עם 15 מ"ל של תמיסת בידוד לימפוציטים (צפיפות 1.077 גרם / מ"ל) עם מזרק ומחט ברזל. הניחו את המחט בתחתית הצינור ודחפו בעדינות את תמיסת בידוד הלימפוציטים החוצה. צנטריפוגה ב 630 x g במשך 20 דקות ללא בלימה והאצה נמוכה.
- מכינים PBS, מקורר על קרח.
הערה: שלבים 3.4 ו -3.5 חייבים להתבצע בו זמנית כדי ליצור מונוציטים (3.4) ונויטרופילים (3.5).
- באמצעות פסטטה, לקצור את שכבת תאי הדם החד-גרעיניים ההיקפיים (PBMC). זוהי השכבה במרכז שבין הסרום הצהוב (העליון) לבין תמיסת בידוד הלימפוציטים השקופה (התחתונה), ומעבירה לצינור טרי של 50 מ"ל.
- מלא את הצינור עם PBMC עד 50 מ"ל עם PBS קר וצנטריפוגה ב 582 x גרם במשך 10 דקות. להסיר את supernatant ולשטוף פעמיים עם PBS קר resuspend ב 1 מ"ל של PBS לכל 20 מ"ל של דם התורם בשימוש בהתחלה.
- בצע דילול של 1:10 לספירה על ידי הוספת 20 μL של תרחיף התא ל- 160 μL של PBS ו- 20 μL של כחול טריפאן. לספור תאים עם hemocytometer.
- הכינו תמיסת חיץ על ידי הוספת 26 מ"ל של נסיוב עגל עובר מומת בחום (FCS) ו-2.1 מ"ל של 0.5 מ"ל EDTA עד 500 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS). צנטריפוגה את התאים למשך 10 דקות ב 515 x g והשהיה מחדש ב 40 μL של תמיסת חיץ לכל 1 x 107 תאים.
- מעבירים את תרחיף התא לצינור של 15 מ"ל ומוסיפים 10 מיקרו-כדוריות CD14 לכל 1 x 107 תאים, מערבבים היטב ודגרים במשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, תוך הקפדה על ערבוב הצינורות כל 5 דקות.
- לשטוף תאים על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת חיץ לכל 1 x 107 תאים וצנטריפוגה ב 515 x גרם במשך 10 דקות.
- שאפו סופרנאטנט לחלוטין והשהו עד 1 x 108 תאים ב 500 μL של תמיסת חיץ.
- יש להניח עמודה אחת בכל דגימה על מפריד מגנטי בהתאם להוראות היצרן. ראשית, שטפו את העמוד פעם אחת עם 500 מיקרוליטר של תמיסת חיץ.
- פיפטה 500 μL של תרחיף התא דרך העמודה, לחכות עמוד להתייבש, ולאחר מכן לשטוף על ידי חזרה על זה שלוש פעמים עם תמיסת חיץ.
- הניחו צינור חדש של 15 מ"ל מתחת לעמוד והסירו את העמוד מהמפריד המגנטי. לאחר מכן לשטוף את התאים מתוך העמודה לתוך הצינור עם 1 מ"ל של תמיסת חיץ.
- הוסף 4 מ"ל של תמיסת חיץ וצנטריפוגה ב 515 x גרם למשך 10 דקות, ולאחר מכן להשהות מחדש ב 1 מ"ל של תווך Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
- בצע דילול של 1:10 לספירה על ידי הוספת 20 μL של תרחיף התא ל- 160 μL של PBS ו- 20 μL של כחול טריפאן. לספור את התאים עם hemocytometer.
- כוונן את ריכוז התאים ל- 6 x 105/mL עם RPMI וזרעים 200 μL על צלחת הדמיה מבוססת זכוכית 35 מ"מ. יש לדגור למשך הלילה ב-37°C עם 5% CO2.
- למחרת, לפני ההדמיה, להסיר את RPMI ולהוסיף 200 μL של CO2-independent medium.
הערה: מונוציטים אלה יכולים גם להיות מובחנים לתת-קבוצות מקרופאגים שונות לפני ההדמיה. אם זוהי טכניקה שיש לחקור, נקודת התחלה מצוינת היא מאמר שנערך לאחרונה על ידי Ohradanova-Repic et al.
- לאחר קצירת שכבת PBMC, הסירו את כל הסרום ואת רוב תמיסת בידוד הלימפוציטים, אך היזהרו שלא להסיר את הפס הלבן הקטן מעל הגלולה האדומה מכיוון שזה יכיל את רוב הנויטרופילים.
- הכינו מלאי חיץ ליזה היפוטוני 10x על ידי הוספת 83 גרם אמוניום כלורי (NH4Cl) ו-10 גרם אשלגן ביקרבונט (KHCO3) בליטר אחד של מים סטריליים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
- לדלל את הציר הזה 10x עם מים סטריליים ולהוסיף אותו צינורות. לאחר מכן, בזהירות להפוך 3 פעמים לדגור בקרח במשך 15 דקות.
- צנטריפוגה ב 394 x גרם במשך 10 דקות והשעיה מחדש בחיץ ליזה היפוטוני במשך 10 דקות בקרח.
- צנטריפוגה ב 394 x גרם ולשטוף פעמיים עם PBS קר. יש להשהות מחדש ב-1 מ"ל של CO2-Independent medium לכל תורם.
- בצע דילול של 1:10 לספירה על ידי הוספת 20 μL של תרחיף התא ל- 160 μL של PBS ו- 20 μL של כחול טריפאן. לספור את התאים עם hemocytometer.
- למיקרוסקופיה, יש להוסיף 200 μL של אותו תרחיף תאים לצלחת הדמיה מבוססת זכוכית בקוטר 35 מ"מ.
הערה: הדמיה נויטרופילית או ציטומטריית זרימה צריך להתחיל מיד בשל הנטייה שלהם לעבור אפופטוזיס אם לא מגורה. אם זה לא אפשרי, נויטרופילים צריכים להישמר על קרח ולהשתמש בהקדם האפשרי (בתוך אותו יום).
4. מיקרוסקופ וידאו בתא חי
הערה: בחירת המיקרוסקופ תהיה תלויה במה שזמין באופן מקומי, אך מערך המיקרוסקופ יצטרך לכלול שלב הפוך, תא סביבתי מחומם ל-37°C ומסנני עירור/פליטה מתאימים עבור dsRed (532/561 ננומטר) ו-AF633 (633 ננומטר). קרנידיה התלקחות אינן פועלות עם לייזר 488 ננומטר במקום לייזר 532/561 ננומטר עבור dsRed. בעת ביצוע ניסוי זה בפעם הראשונה, השתמש בבקרת conidia ללא צבע וצבע יחיד כדי לבדוק פלואורסצנטיות רקע ודימום בין ערוצי dsRed ו- AF633.
- הפעל את מחמם המיקרוסקופ לפני הניסוי ואפשר מספיק זמן לתא הבקרה הסביבתי להתחמם ל -37 מעלות צלזיוס. הזמן שייקח לטמפרטורת התא להתייצב ישתנה עבור הגדרות מיקרוסקופ שונות.
- הפעל את המיקרוסקופ והמחשב, וטען את תוכנת ההדמיה. הרכיבו את צלחת ההדמיה על במת המיקרוסקופ והתאימו את המיקוד כדי למצוא את הנויטרופילים או המונוציטים האנושיים.
- עבור dsRed ו- AF633, הגדר את עוצמת הלייזר ל- 10% ואת זמן החשיפה ל- 1 שנייה בהגדרות הרכישה.
- הסר את שקופית ההדמיה והוסף 100 μL של 3 x 106/mL התלקחות קונידיאלית לבארות המתאימות (נפח כולל 300 μL / באר). רשום את הזמן שבו מוסיפים קונידיה של FLARE למנה.
- החזר את השקופית לבמה וכוונן את רגישות המצלמה עבור dsRed ו- AF633 כדי לראות בבירור את הקונידיה אך לא לחשוף את התמונה יתר על המידה. הגדר רשימת נקודות שלב אם נדרשת רכישה מרובת נקודות.
- התחל הדמיה כאשר כל הנקודות ממוקדות, הערוצים ממוטבים וזמן ומשך המחזור מוגדרים. זמן המחזור ומשך ההדמיה תלויים בשאלת הניסוי. המטרה היא לשמור על זמן מחזור קצר ככל האפשר (≤2 דקות) עם דקה אחת המאפשרת ניתוח מעמיק של דינמיקת קליטה.
