שימוש בשכבות שומנים הנתמכות על ידי חרוזים כדי לחקור את הפלט הסינפטי מתאי T

תקציר

מקור: Céspedes, P. F., et al. הכנת שכבות שומנים נתמכות חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של סינפסות חיסוניות של תאי T. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים את ההרכבה מחדש של תאים סינתטיים מציגי אנטיגן באמצעות דו-שכבות ליפידים הנתמכות על ידי חרוזים ויישומם בהערכת הפלט הסינפטי שנוצר על ידי תאי T פעילים.

פרוטוקול

1. כיול צפיפות חלבון ב-BSLBs (דו-שכבות שומנים הנתמכות בחרוזים)

1. לפני נטילת חרוזי סיליקה לא פונקציונליים בקוטר 5.00 ±0.05 מיקרומטר, ערבבו היטב את תמיסת הציר והשהו מחדש את כל גושי החרוזים הגדולים המשקעים בתחתית הצלוחיות.
   הערה: חרוזי סיליקה נוטים לשקוע במהירות, מה שעלול להוביל לשגיאות ספירה. יש לערבב נמרצות על-ידי פיטום למעלה ולמטה של מחצית מהנפח המרבי של מיקרופיפטה P1000.
2. לדלל 1 μL של תמיסת חרוזים ב 1,000 μL של PBS, לספור את החרוזים באמצעות תא hemocytometer, ולחשב את הריכוז שלהם לכל mL.
   הערה: צביעה כחולה טריפאן אינה נחוצה להדמיית חרוזי סיליקה.
3. חשב את נפח חרוזי הסיליקה הדרושים עבור 5 × 10⁵ BSLB סופיים לכל נקודה של הטיטרציה.
4. מעבירים את הנפח הנדרש של חרוזי סיליקה לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל.
5. שטפו את חרוזי הסיליקה שלוש פעמים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי, וצנטריפוגו את החרוזים במשך 15 שניות על מיקרוצנטריפוגה על ספסל ב- RT (בסל"ד קבוע).
   הערה: בעת הסרת תמיסת הכביסה, הימנע מלהפריע לגלולת החרוזים. עמודת חיץ קטנה לא תשפיע על התפשטות הליפוזומים המרכיבים את תערובת האב הליפוזומית מכיוון שהם נמצאים גם ב-PBS.
6. הכינו שלושה כרכים של תערובת מאסטר הליפוזומים כדי להרכיב את BSLB על חרוזי הסיליקה השטופים (למשל, אם הנפח הכולל ההתחלתי של חרוזי סיליקה הוא 20 מיקרוליטר, הכינו מינימום של 60 מיקרוליטר של תערובת מאסטר ליפוזום).
7. עבור Biotinyl Cap PE mol% titrations
   1. הכינו את תערובות המאסטר לשומנים המכילות דילול פי 5 של Biotinyl Cap PE.
      1. לדלל את 0.4 mM Biotinyl Cap PE mol% במטריצה 100% DOPC.
      2. יש לערבב כל נקודת טיטרציה של Biotinyl Cap PE mol% ביחס של 1:1 (vol: vol) עם תמיסה של 0.4 mM 25% DGS-NTA(Ni) כך ש-12.5% mol% סופיים של שומנים המכילים Ni נמצאים בכל הטיטרציות.
         הערה: 12.5 mol% (vol:vol%) של שומנים המכילים Ni מייצגים את הרכב השומנים המעורבים של BSLBs, שעליהם ניתן לבדוק חלבונים מתויגים גם בכיולים מקבילים. לדוגמה, מאחר שכל מלאי הליפוזומים מוכן באותו ריכוז מולארי, כדי להגיע לתערובת היעד mol% ב-200 μL של תערובת ליפוזומים סופית, פשוט ערבבו 100 μL של 25 mol% של DGS-NTA המכיל Ni עם 100 μL של 100 mol% DOPC.
   2. העבר 5 × 10⁵ חרוזי סיליקה שטופים לצינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל, כך שנקודת טיטרציה אחת של Biotinyl Cap PE mol% מורכבת לכל צינור.
   3. הוסיפו את תערובות המאסטר לטיטרציה של Biotinyl Cap PE mol% לחרוזי הסיליקה השטופים וערבבו בעדינות על ידי זילוף למעלה ולמטה של מחצית מהנפח הכולל. הימנע יצירת בועות, אשר עודף להרוס את bilayer השומנים.
   4. הוסף גז ארגון (או חנקן) על הצינור המכיל את BSLBs שנוצרו כעת כדי להזיז אוויר ולהגן על השומנים מפני חמצון במהלך הערבוב.
   5. הוסף את Argon למלאי השומנים של 0.4 mM לפני האחסון ותפעל בטכניקה סטרילית.
      הערה: חברו צינור קטן לבלון גז ארגון/חנקן. לפני הוספת גז לצינורות, להתאים את וסת בלון הגז כך שהלחץ מוגדר לא גבוה מ 2 psi. חבר קצה פיפטה סטרילי לצינור היציאה כדי לכוון את זרם הגז בתוך מלאי הליפוזום למשך 5 שניות ולסגור במהירות את המכסה. במקרה של מלאי שומנים, אטמו את מכסה הצינור בסרט פרפין לפני אחסונו.
   6. העבר את BSLBs למערבל מעבדה אנכי בעל זווית משתנה (ראה טבלת חומרים) וערבב במשך 30 דקות ב- RT באמצעות ערבוב מסלולי של 10 סל"ד.
      הערה: שלב זה ימנע שקיעה של חרוזים במהלך היווצרות של bilayer שומנים נתמך.
   7. סובבו את החרוזים למטה על ידי צנטריפוגה במשך 15 שניות ב- RT על מיניצנטריפוגה על ספסל, ולאחר מכן שטפו שלוש פעמים עם 1 מ"ל של HBS/HSA (BSA) כדי להסיר ליפוזומים עודפים.
   8. חסום את BSLBs שנוצרו על ידי הוספת 1 מ"ל של 5% קזאין או 5% BSA המכיל 100 מיקרומטר של NiSO₄ כדי להרוות אתרי NTA ו 200 ננומטר סטרפטאווידין כדי לצפות את כל אתרי עיגון הביוטין על BSLBs באופן אחיד. מערבבים בעדינות על ידי פיטום למעלה ולמטה של מחצית מהנפח הכולל ודגרים במיקסר האנכי לא יותר מ-20 דקות ב-RT וב-10 סל"ד.
   9. סובב למטה את BSLBs על ידי צנטריפוגה במשך 15 שניות ב- RT על מיניצנטריפוגה benchtop, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של HBS/HSA (BSA) buffer.
      הערה: שמור חרוזים שטופים במאונך עם נפח קטן של חיץ כביסה המכסה את BSLBs. הימנע מהתייבשות של BSLBs כמו האוויר יהרוס את bilayer השומנים.
8. לטיטרציה של חלבונים מתויגים His-tagged על 12.5mol% של BSLBs המכילים DGS-(Ni) NTA
   1. הכינו שלושה כרכים של תערובת מאסטר ליפוזומים המכילים 12.5% מול-% סופיים של DGS-NTA(Ni).
   2. השתמשו בתערובת המאסטר של הליפוזום כדי להשהות מחדש את חרוזי הסיליקה שנשטפו וערבבו בעדינות על ידי פיפטציה למעלה ולמטה של מחצית מהנפח הכולל. הימנע יצירת בועות, אשר עודף לפגוע bilayer השומנים.
   3. הוסף גז ארגון (או חנקן) על הצינור המכיל את BSLBs שנוצרו כעת כדי להזיז אוויר ולהגן על השומנים מפני חמצון במהלך הערבוב.
   4. הוסף ארגון למלאי השומנים של 0.4 מילימטר לפני האחסון ותפעל בטכניקה סטרילית.
   5. העבר את ה- BSLB למערבל האנכי וערבב במשך 30 דקות ב- RT באמצעות ערבוב אורביטלי ב- 10 סל"ד.
   6. סובבו את החרוזים למטה על ידי צנטריפוגה במשך 15 שניות ב- RT על מיניצנטריפוגה על ספסל, ולאחר מכן שטפו שלוש פעמים עם 1 מ"ל של HBS/HSA (BSA) כדי להסיר ליפוזומים עודפים.
   7. חסום את BSLBs שנוצרו על ידי הוספת 1 מ"ל של 5% קזאין (או 5% BSA) המכיל 100 מיקרומטר של NiSO4 כדי להרוות אתרי NTA על BSLBs. מערבבים בעדינות ודגרים במערבל האנכי לא יותר מ -20 דקות ב- RT וב- 10 סל"ד.
   8. שטפו שלוש פעמים באמצעות HBS/HSA (BSA) כדי להסיר את תמיסת החסימה העודפת.
   9. בצלחת U-bottom חדשה של 96 בארות מכינים דילול סדרתי פי 2 של החלבונים.
      1. הכן ריכוז התחלתי של 100 ננומטר עבור החלבון המעניין בנפח כולל של 200 μL של מאגר HBS/HSA (BSA), הפץ 100 μL של תמיסה זו בעמודה הראשונה, ואת 100 μL הנותרים על גבי עמודה #2 המכילה 100 μL של מאגר HBS/HSA (BSA).
      2. המשך על ידי העברה סדרתית של 100 μL מעמודה #2 לעמודה #3 וחזור לפי הצורך כדי לכסות את כל נקודות הטיטרציה. השאר את העמודה האחרונה של הסדרה ללא חלבון, מכיוון שזה ישמש כהפניה ריקה לכימות.
   10. השהה מחדש את ה- BSLBs המוכנים בנפח כך ש- 5 × 10⁵ BSLB כלולים במאגר של 100 μL של HBS/HSA (BSA).
   11. העבר 100 μL של השעיית BSLB לבארות של צלחת U-bottom שנייה של 96 בארות, כך שכל באר מקבלת 5 × 10⁵ BSLBs.
   12. סובבו את הצלחת השנייה המכילה BSLBs למשך 2 דקות ב-300 × גרם ו-RT והשליכו את הסופרנטנט.
   13. העבירו את נפחי 100 μL מצלחת הטיטרציה של החלבון לצלחת המכילה את ה-BSLB המשוקעים. ערבבו בעדינות, הימנעו מעודף יצירת בועות בזמן הפיפטה, ודגרו במשך 30 דקות ב-RT וב-1,000 סל"ד באמצעות שייקר צלחת. יש להגן מפני אור עם רדיד אלומיניום.
   14. שטפו את הצלחת שלוש פעמים עם מאגר HBS/HSA (BSA) באמצעות שלבי שיקוע של 300 × גרם למשך 2 דקות ב-RT.
   15. אם החלבון הרקומביננטי המשמש בכיול מצומד ישירות לפלואורוכרום ויש לו ערכי F/P ידועים.
   16. אם החלבון הרקומביננטי המשמש בכיול אינו מסומן או מצומד לפלואורוכרום או שאין תקן חרוזי MESF זמין, השתמש בנוגדנים מצומדים Alexa Fluor 488 או 647 עם ערכי F/P ידועים כדי להכתים את BSLB מצופה החלבון.
   17. כתם בריכוזים רוויים של נוגדני כימות.
       הערה: בהתאם לרמת ביטוי היעד, אלה נעים בין 5 ל- 10 מיקרוגרם/מ"ל.
   18. צבעו במשך 30 דקות ב-RT וב-1,000 סל"ד באמצעות שייקר פלטות. יש להגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
   19. יש לשטוף פעמיים עם HBS/HSA (BSA) ופעם אחת עם PBS באמצעות שלבי שיקוע של 300 × גרם למשך 2 דקות ב-RT.
       הערה: השתמש PBS, pH 7.4 כדי להשעות מחדש את BSLBs שטופים לפני הרכישה. אין להשתמש במאגרים המכילים חלבון, מכיוון שהדבר מוביל להיווצרות בועות במהלך ערבוב אוטומטי של דגימות עם דוגמים בעלי תפוקה גבוהה.
   20. רכשו את תקני MESF, וודאו שהפסגות הבהירות ביותר נשארות בטווח הגילוי הליניארי של גלאי הכימות (ערוץ), כפי שמוצג באיור 1B (vii).
   21. רכוש את הדגימות באופן ידני או באמצעות HTS. אם משתמשים באפשרות השנייה, יש להשהות מחדש BSLBs ב-100 μL של PBS ולרכוש 80 μL באמצעות קצב זרימה בין 2.5 ל-3.0 μL/s, נפח ערבוב של 100 μL (או 50% מהנפח הכולל אם נפח המתלים קטן יותר), מהירות ערבוב של 150 μL/s וחמש תערובות כדי להבטיח ש-BSLBs יהיו חד-מפוזרים.
   22. ייצא את קבצי FCS.
   23. התמקדו באירועים בודדים עבור הניתוחים (איור 2A), שכן כפילים או שלישיות יציגו טעויות בקביעה. השתמש בזיהוי מקונן של אירועים בודדים כפי שמצוין בשלב 1.2.3 של הפרוטוקול.
   24. מדוד את ה- MFI של כל חלק MESF (1-4) והחסר את ה- MFI של חרוזים ריקים כדי לחלץ MFIs מתוקנים (cMFI).
   25. בצע ניתוח רגרסיה ליניארית כדי לחלץ את השיפוע (b) של MESF מעל cMFI המחושב עבור תקני MESF.
   26. חלץ את ה- MFI של כל נקודת טיטרציה והחסר את ה- MFI של חרוזים ללא חלבון כדי להשיג cMFIs.
   27. חלק את cMFIs עם השיפוע המחושב כדי לחלץ את MESF קשור BSLBs עבור כל נקודת טיטרציה.
   28. חלק MESF הקשור ל- BSLBs בערך F/P של נוגדן הכימות כדי לחלץ את המספר הממוצע של מולקולות הקשורות לכל BSLB.
   29. באמצעות הקוטר של BSLBs (5.00 ± 0.05 מיקרומטר), לחלץ את שטח הפנים של החרוז (SA = 4pr2) כדי לחשב את הצפיפויות הסופיות של חלבון (molec./μm²) לכל נקודת טיטרציה (ריכוז חלבון).
   30. בצע ניתוח רגרסיה חדש של ריכוז חלבון על פני צפיפות חלבון כדי לחשב את השיפוע (b) של קו ההתאמה הטובה ביותר.
       הערה: ריכוז של 12.5 mol% של DGS-NTA(Ni) מקנה יכולת עיגון מקסימלית של כ-10,000 מולק./μm2 10 מבלי לגרום להפעלה לא ספציפית של תאי T או להשפיע על הניידות הצידית של SLBs.

2. ביצוע ניסויי העברה סינפטית בין תאי T ו-BSLBs

1. לפני הפעלת ניסוי ההעברה הסינפטית
   1. רכשו BSLBs שאינם פלואורסצנטיים, BSLBs עם שומנים פלואורסצנטיים, תאים לא מוכתמים (או חרוזי פיצוי; ראו טבלת חומרים) ותאים מוכתמים בצבע יחיד (או חרוזי פיצוי) כדי לזהות את אינטראקציות ספקטרום הפלואורסצנטיות של המכשיר. התמקדו באותם גלאים עם התפשטות זליגה גבוהה כדי לעצב מחדש את הלוח הפוליכרומטי, להגביר את הרגישות ולהפחית את טעות המדידה בגלאים קריטיים.
   2. בצע טיטרציה של נוגדני הזיהוי כדי למצוא את הריכוז האופטימלי, המאפשר זיהוי אירועים חיוביים מבלי לפגוע בזיהוי שליליים.
      הערה: חזור על שלב זה בכל פעם שיש שינוי בכמות הנוגדנים מכיוון שערכי F/P והבהירות משתנים מאצווה לאצווה.
   3. אופציונלי: מטב את מתחי PMT על ידי רכישת הדגימה בטווחי מתח שונים (כלומר, הליכות מתח) כדי למצוא את ה- PMT המוביל לאות אופטימלי על פני רעש (כלומר, הפרדה של שליליים וחיוביים תוך הבטחת האות של האוכלוסייה הבהירה ביותר נשאר בטווח הליניארי).
2. מדידת העברת פלט תאי T ל- BSLBs
   1. הכינו תוספת RPMI 1640 (להלן R10 בינוני) המכילה 10% של סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 100 מיקרומטר חומצות אמינו לא חיוניות, 10 מ"מ HEPES, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 מ"מ נתרן פירובט, 100 U/ml פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. השתמש בתווך R10 כדי לגדל תאי T בתרבית ולהרחיב אותם.
   2. ביום הראשון, בודדו תאי T מתאי דם היקפיים או מתאי מערכת לוקורדוקציה (LRS). השתמש בערכות בידוד והפרדת תאים בצפיפות חיסונית (ראה טבלת חומרים) להעשרת תאי T CD4+ ו- CD8+ אנושיים.
   3. זרעו את התאים בריכוז סופי הנע בין 1.5 ל -2.0 × 10⁶ תאים / מ"ל, באמצעות לוחות 6 בארות עם לא יותר מ 5 מ"ל בסך הכל לכל באר.
   4. הפעל תאי T באמצעות יחס של 1:1 של הפעלת תאי T אנושיים (anti-CD3/anti-CD28) חרוזים מגנטיים (ראה טבלת חומרים) והוסף 100 IU של IL-2 אנושי רקומביננטי כדי לתמוך בהתרבות תאים ובהישרדותם.
   5. ביום השלישי, הסירו את החרוזים המגנטיים המפעילים באמצעות עמודים מגנטיים (ראו טבלת חומרים). ודא שחרוזים מגנטיים נשארים מחוברים לצידי הצינור לפני שחזור התאים לשלבי שטיפה נוספים.
   6. שטפו את החרוזים המגנטיים פעם נוספת עם 5 מ"ל של מדיום R10 טרי, ערבבו היטב והחזירו אותם למגנט. לשחזר נפח זה ולערבב אותו עם התאים התאושש בשלב 1.2.5.
   7. השהה מחדש את התאים ל- 1.5-2 × 10⁶ תאים/מ"ל ב- R10 טרי המכיל 100 U/mL של IL-2. לחדש את המדיום לאחר 48 שעות, לוודא כי התוספת האחרונה של IL-2 הוא 48 שעות לפני יום הניסויים (ימים 7 עד 14 של תרבות).
   8. ביום ניסוי ההעברה הסינפטית, הכינו את מדיום בדיקת ההעברה הסינפטית על ידי תוספת מדיום פנול ללא אדום RPMI 1640 עם 10% FBS, 100 מיקרומטר חומצות אמינו לא חיוניות, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 מ"מ נתרן פירובט, 100 U/ml פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. אין לכלול IL-2 אנושי רקומביננטי.
   9. ספרו תאים באמצעות צביעה כחולה טריפאן או הרחקת זרם חשמלי והשהו אותם מחדש לריכוז סופי של 2.5 × 10⁶ תאים/מ"ל בתווך. אם נצפתה מוות תאי מופרז (>10%), הסירו תאים מתים/גוססים באמצעות תערובת של פוליסכריד ונתרן דיאטריזואט (ראו טבלת חומרים) באופן הבא:
      1. שכבה 15 מ"ל של תרבית תאים על גבי 13 מ"ל של תמיסת פוליסכריד-נתרן דיאטריזואט.
      2. צנטריפוגה ל-1,250 × גרם למשך 20 דקות ב-RT עם מינימום האצה והאצה. אסוף את שכבת התא (ענן) בממשק בין התווך לבין תמיסת פוליסכריד-נתרן דיאטריזואט.
      3. שטפו את התאים לפחות פעמיים עם מדיום Synaptic Transfer Assay שחומם מראש (הוכן בשלב 1.2.7).
      4. ספירה והשעיה מחדש של התאים לריכוז סופי של 2.5 × 10⁶/מ"ל באמצעות מדיום Synaptic Transfer Assay. Coculture 100 μL של תרחיף תא זה עם BSLBs (ראה שלב 1.2.15).
   10. חשב את מספר BSLBs הדרושים לניסוי; שקול את כל תערובות האב השונות של חלבונים וטיטרציות אנטיגן לבדיקה (מונומרים HLA/MHC-פפטיד ביוטינילציה או מונוביוטינילציה אנטי CD3ε Fab).
   11. הרכיבו את ה-BSLBs על-ידי ביצוע אותם שלבים מפרוטוקול סעיף 5, אולם הפעם, שלבו את כל הטיטרציות של חלבונים ושומנים הדרושים כדי ליצור מחדש קרום APC מורכב (איור 3A). שמור על אותם יחסי vol: vol בין נפח חרוזי הסיליקה הראשוני לבין נפח תערובת החלבונים המשמשת במהלך כיולים, כמו גם זמנים וטמפרטורות המשמשים בהעמסת BSLBs. לדוגמה, אם 0.5 μL של חרוזי סיליקה / באר ו 100 μL / באר של תערובת חלבונים שימשו לכיול הראשוני, לשמור על יחס של 5:1,000 vol:vol כדי להכין את BSLBs להיות cocultured עם תאי T.
   12. לאחר ש-BSLBs הועמסו בתמהיל החלבונים המעניין, שטפו את ה-BSLBs פעמיים עם HBS/HSA (BSA) כדי להסיר חלבונים לא קשורים עודפים. השתמשו במהירויות שיקוע של 300 × גרם במשך 2 דקות ב-RT בכל שלב כביסה והשליכו את הסופרנאטנטים.
   13. להשעות מחדש את 5 × 105 BSLBs לכל באר ב 200 μL.
   14. העבר 100 μL לכל באר לצלחת U-bottom חדשה של 96 בארות כדי לבצע שכפול, כך שהכמות הסופית של BSLB לכל באר היא 2.5 × 10⁵.
   15. סובבו את ה-BSLBs ב-300 × גרם למשך 2 דקות ו-RT והשליכו את הסופרנטנט.
   16. להשעות מחדש את BSLBs באמצעות 100 μL של השעיית תאי T; מערבבים בעדינות כדי למנוע היווצרות של בועות.
   17. לדגור על תרביות במשך 90 דקות ב 37 ° C.
       הערה: לחלופין, תאים וחרוזים יכולים להיות תלויים מחדש במאגר HBS/HSA (BSA) במקום RPMI חופשי פנול-אדום עבור coculture. במקרה זה, הדגירה חייבת להתבצע באינקובטור שאינו CO₂ מכיוון שגז זה יחמיץ במהירות את החיץ בהיעדר ביקרבונט.
   18. קררו את תרביות תאי BSLB-T על ידי דגירה ראשונה של התאים ב-RT למשך 15 דקות לפחות. הגנו עליהם מפני אור.
   19. צנטריפוגה את התאים במשך 5 דקות ב 500 × גרם RT; להשליך את supernatant.
   20. השהה מחדש את התאים ב- RT 2% BSA-PBS (ללא Ca₂⁺ ו- Mg₂⁺) לחסימה. מניחים את התאים על קרח למשך 45 דקות. יש להגן מפני אור.
   21. בזמן הדגירה על התאים, הכינו את תערובת האב של הנוגדנים באמצעות 2% BSA מסונן כקרח 0.22 מיקרומטר ב-PBS כחיץ צביעה, שיספק חסימה נוספת.
       הערה: חלק מאצוות הנוגדנים המצומדות לצבעי Brilliant Violet נוטות להיקשר ל-BSLB באופן לא ספציפי. חסימה עם 5% BSA-PBS מסייעת להפחית רעש זה. מעתה ואילך, הקפידו לשמור על שרשרת הקור ללא שבירה.
   22. סובב את cocultures ב 500 × גרם במשך 5 דקות ו 4 ° C. לפני השלכת הסופרנאטנטים, ודא בקצרה שהגלולה קיימת על ידי בדיקת תחתית הצלחת בעלת 96 הקידוחים באמצעות תאורה אחורית.
   23. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להשהות מחדש את התאים בתערובת האב צביעה המכילה ריכוזי נוגדנים אופטימליים.
       הערה: השתמש בקצוות פיפטה ללא מסנן כדי למנוע יצירת בועות ושגיאות בפיזור נפחי הצביעה.
   24. כלול תאים המסומנים באיזוטיפ ו- BSLBs, BSLB פלואורסצנטי ולא פלואורסצנטי, ותאים ו- BSLBs מוכתמים בלבד. כבדו את המספר הכולל של אירועים לכל באר עבור כל הבקרות (כלומר, רק בקרות BSLB המכילות 5 × 10⁵ BSLB / well, ורק בקרות תאים המכילות 5 × 10⁵ תאים / באר כדי למנוע עלייה יחסית של נוגדנים לכל אירוע מוכתם).
   25. מערבבים בעדינות על ידי פיטום למעלה ולמטה של מחצית מהנפח ודגרים במשך 30 דקות על קרח. יש להגן מפני אור.
   26. שטפו את התאים ואת ה-BSLBs פעמיים באמצעות 2% BSA-PBS קרים כקרח, pH 7.4 ושלבי שיקוע של 500 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C. השהו מחדש את התרביות שנשטפו ב-100 מיקרוליטר של PBS ורכשו מיד.
   27. אם יש צורך בקיבוע, תקן באמצעות 0.5% w/v של PFA ב- PBS למשך 10 דקות, שטוף פעם אחת ושמור ב- PBS עד לרכישה. יש להגן מפני אור.
   28. לפני הפיצוי, רכוש תקני MESF, כדי להבטיח שגם האוכלוסיות העמומות ביותר וגם הבהירות ביותר נופלות בטווח המדידה הלינארי.
   29. לרכוש דגימות פיצוי, לחשב פיצוי וליישם את מטריצת הפיצוי (קישור) לניסוי.
   30. רכוש ושמור לפחות 2 × 10⁴ תקני MESF סה"כ עבור כל אחד מערוצי הכימות.
   31. לרכישה באמצעות דוגמים בעלי תפוקה גבוהה, הגדר רכישת מכשירים לסטנדרט, הגדר את רכישת הדגימה ל- 80 μL (או 80% מהנפח הכולל), קצב זרימת דגימה בין 2.0 ל- 3.0 μL/s, נפח ערבוב דגימה של 50 μL (או 50% מהנפח הכולל כדי למנוע היווצרות בועות במהלך הערבוב), ערבוב דגימה של 150 μL/s, וערבוב לבאר בין 3 ל-5.
   32. רכשו לפחות 1 × 10⁴ BSLBs בודדים לכל דגימה (עיינו באיור 3B פאנלים (i)-(vi) עבור אסטרטגיית הייחוס
   ).
   33. שטפו את הציטומטר במשך 5 דקות בתמיסת ניקוי ואחריה 5 דקות של מים טהורים במיוחד לפני כיבוי המכשיר. אם אתה משתמש ב- HTS, עקוב אחר האפשרויות תחת הכרטיסייה HTS והאפשרות נקי.
   34. ייצוא קבצי FCS.

3. מדידת העברה סינפטית של חלקיקים ל-BSLBs

1. פתח את קבצי FCS הניסיוניים. בחרו את אוכלוסיית התאים וה-BSLB בהתבסס על אזורי פיזור האור הצדיים והקדמיים שלהם (SSC-A לעומת FSC-A), כפי שמוצג באיור 3B (i).
2. בחר את האירועים בחלון הרכישה הרציפה (איור 3B (ii)).
3. התמקדו באירועים הבודדים של שני התאים ושל BSLB; זהה תאים בודדים תחילה בהתבסס על W נמוך בשערים הרציפים FSC-W/FSC-H (singlets-1, איור 3B panel (iii)) ו-SSC-W/SSC-H (singlets-2; איור 3B בלוח (iv)). הגדר שער סינגלט-3 נוסף על-ידי בחירת אירועים עם FSC-A ו-FSC-H פרופורציונליים (איור 3B, לוח (v)).
4. חלץ את ה- MFI של שברי MESF ריקים ו- 1 עד 4 ומתאים בודדים ו- MESF עבור כל דגימת ניסוי.
5. צור ערכי MFI מתוקנים (cMFI) עבור שברי MESF 1 עד 4 על-ידי הפחתת ה- MFI של אוכלוסיית החרוזים הריקים מכל שבר.
6. צור cMFIs עבור BSLB ותאים בודדים (עיין בלוח איור 3C (i)).
7. השתמש באות מ- BSLB המוכתם בנוגדנים לבקרת איזוטיפ כדי לתקן את ה- MFI של BSLB המוכתם בנוגדנים כנגד הסמנים הרלוונטיים של תאי T. השתמש ב- cMFI כדי לחשב את אחוז ההעברה הסינפטי המנורמל (NST%) באמצעות המשוואה המוצגת בלוח איור 3C (ii).
8. אם אתם מעוניינים במקום זאת בחלקיקים המועברים באופן ספציפי בתגובה להפעלת TCR, הפחיתו את האות מ-BSLBs ריקים מה-MFI של BSLB אגוניסטים. השתמשו ב-cMFI זה כדי לחשב את ה-NST% מונחה ה-TCR באמצעות המשוואה המוצגת בלוח איור 3C (ii).
9. אם אתם מעוניינים לקבוע את המספר הכולל של מולקולות המועברות כמטען חלקיקים על פני ממשק T cell-BSLB, רכשו חרוזי MESF benchmark באמצעות אותן הגדרות מכשיר וסשן רכישה עבור תרבויות T cell-BSLB.
10. נתח אוכלוסיות חרוזי MESF וחלץ את cMFIs שלהם. חשב את שיפוע הקו המתאים ביותר לניתוח רגרסיה של MESF מעל cMFI.
11. השתמש בשיפוע המחושב כדי לחלץ את מספר MESF שהופקד ב- BSLBs. השתמש ב- cMFIs המחושבים באמצעות פקדי איזוטיפ או BSLB ריק כדי לחלץ את מספר MESF המועבר במיוחד ל- BSLB מעורר.
12. חשב את מספר מולקולות הסמנים שהועברו ל- BSLB על ידי חלוקת MESF המחושב (ממוצע) לכל BSLB בערך F/P של נוגדן הכימות.

תוצאות

איור 1: כימות מוחלט של חלבונים על פני השטח של נגמ"שים. (A) דוגמה למדידות ציטומטריית זרימה כמותית של ICAM-1 על פני השטח של תאי שקדים B (Foll. Bc) ותאי T מסייעים (TFH). (ט'-ז') אסטרטגיית Gating לניתוח CXCR5+ Bc ו-TFH בודדים שבודדו משחדי פלטין אנושיים. מוצגת אסטרטגיית gating רציפה לזיהוי אירועים חיים בודדים הכלולים בחלון הרכישה הרציף. (iii-iv) חצים שחור...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
96 Well Cell Cultture צלחת U-bottom עם מכסה, תרבית רקמות מטופלת, לא פירוגנית	כוכב® משנה	3799	עבור צביעת FCM ותרבית משותפת של BSLB ותאים.
96 Well Cell Cultture צלחת V-תחתית עם מכסה, תרבית רקמות מטופלת, לא פירוגנית.	כוכב® משנה	3894	עבור צביעת FCM של תאים או חרוזים בהשעיה.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 ו- A20006
Multiwell 6 באר תרבית רקמות מטופלת עם פלזמה גז ואקום	בז	353046	לטיפוח והרחבה של תאי T מטוהרים CD4+ ו- CD8+.
קזאין מחלב בקר, מתאים למצע לחלבון קינאז (לאחר דפוספורילציה), אבקה מטוהרת
Dynabeads T-Activator אנושי CD3/ CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132ד
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12321ד	להסרת Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 בנפחים קטנים מ-2 מ"ל
DynaMag-15™	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12301ד	להסרת Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 בנפחים קטנים מ-15 מ"ל
סרום בקר עוברי מוסמך, One Sho	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	זקוק להשבתת חום למשך 30 דקות ב- 56 מעלות צלזיוס
CD154 אנטי-אנושי (CD40L), שיבוט 24-31	ביולג'נד	310815 310818	Alexa Fluor 488 ו-Alexa Fluor 647 מצומדות, בהתאמה
אוגר ארמני IgG Alexa Fluor 647 בקרת איזוטיפ, שיבוט HTK888	ביולג'נד	400902	מתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer הגדרה ומעקב אחר חרוזים	בקטון דיקינסון ושות' (BD)	641319	מסלול ביצועים של מכשירים לפני FCM כמותי