השיטה הבאה מותאמת לבדיקת זנים מתחרים עם זנים מייצרי מעכבים.
הערה: פרוטוקול זה כולל ייצור אירוסולים עם תרביות חיידקים. ניתן לבצע זאת רק בחלל כלול תוך יישום שיקולי בטיחות שאושרו באופן מקומי. ריסוס התרבית על צלחות האגר בתוך ארון בטיחות ברמה 2 ימזער את זיהום צלחות האגר והסביבה. זה גם יגן על החוקר מפני שאיפת אירוסולים של החיידקים המרוססים, זהו חשש גדול אם החוקר משתמש באורגניזמים ברמת הכלה 2. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים. האזור שמסביב לצלחת הפטרי מכוסה בצורה הטובה ביותר ברקמה סופגת חד פעמית. מומלץ לבצע טיהור לאחר ריסוס באמצעות אור UV.
1. הכנת צלחות האגר
- הכינו אגר עירוי לב מוח (BHI) בהתאם להוראות היצרן.
- Autoclave אגר BHI ב 121 ° C, 15 פאונד כוח לכל אינץ 'מרובע (psi) במשך 20 דקות, או על פי המלצות יצרן autoclave, כדי לעקר.
- יוצקים 15 מ"ל aliquots של אגר BHI מעוקר לתוך כלי פטרי סטרילי ולאפשר לו להגדיר.
הערה: ודא שכל צלחת אגר לשימוש בבדיקה מקורה באותו מלאי של אגר וכי יש אותה כמות של אגר בכל צלחת. זה מגביל את השונות בחומרים מזינים זמינים ואת דיפוזיה מעכב בין צלחות המאפשר השוואה.
2. הכנת מרק סטרילי
- הכינו ציר BHI בהתאם להוראות היצרן.
- הוסף 10 מ"ל aliquots של BHI 28 מ"ל זכוכית בקבוקים אוניברסליים.
- Autoclave מרק BHI ב 121 ° C, 15 psi במשך 20 דקות, או על פי המלצות היצרן autoclave, כדי לעקר.
הערה: ודא שכל המרק המשמש בבדיקה מקורו באותה אצווה של מרק autoclaved באותו זמן כדי להגביל את השונות בחומרים מזינים, אשר עלול לגרום לשונות בתוצאות.
3. הכנת בקבוקי וופורייזר סטריליים
- יש לפרק את בקבוק הוופורייזר.
- יש לרסס חומר ניקוי פעיל משטח 5% דרך מכשיר האידוי כדי לסלק מזהמים פנימיים, ולהשרות את בקבוק הוופורייזר, המכסה והוופורייזר בחומר הניקוי הפעיל משטח 5% למשך הלילה.
הערה: יש להשתמש בכפפות ובציוד מגן אישי מתאים בעת טיפול בחומרי ניקוי פעילים על פני השטח.
- יבשו את מכשיר האידוי, המכסה והבקבוקים מתחת למכסה מנוע סטרילי של זרימת אוויר.
- מלאו את הבקבוק באתנול 70%, חברו מחדש את הוופורייזר ורססו חלק מהאתנול דרך הוופורייזר.
- הניחו את המכסה על מכשיר האידוי ואחסנו את האתנול בתוכו עד לשימוש.
- מיד לפני השימוש, שטפו את הבקבוק בציר BHI סטרילי ורססו את המרק דרך מכשיר האידוי.
הערה: זה מונע מהאתנול להשפיע על החיסון שנוסף לבקבוק בסעיף 6.3.
4. הכנת תרביות הלילה של החיידקים
- פזרו את זני המתחרה והמעכב על צלחת אגר BHI סטרילית ודגרו בטמפרטורה אירובית של 37°C למשך כ-18 שעות (לילה).
הערה: צלחת זו מייצרת מלאי של חיידקים שניתן להשתמש בהם עבור מספר עותקים משוכפלים באותו שבוע כאשר מאוחסנים ב 4 ° C.
- יש לחסן 10 מ"ל של ציר BHI סטרילי במושבה אחת של הזן החיידקי המתחרה הנדרש בתוך בקבוק אוניברסלי של 28 מ"ל.
- יש לדגור על הבקבוק האוניברסלי בטמפרטורה אירובית של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה על ידי טלטול ב-250 סל"ד בשייקר מסלולי.
5. תרבית נקודתית של בידוד המייצר מעכבים
- הכינו את תרביות הלילה כמתואר בסעיף 4.
- ודאו שצלחות האגר יבשות לחלוטין, ללא עיבוי על המכסה, לפני החיסון (למשל על ידי דגירה על הצלחת למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37°C); זה מונע מהחיסון להתפשט על פני הצלחת מאתר החיסון.
- פיפטה 25 μl של תרבות הלילה על מרכז צלחות אגר. הימנעו מלחיצה מוחלטת של בוכנה פיפטה כדי למנוע בועות אוויר שמרססות תרבית על פני האגר.
- תנו לתרבית להתייבש בטמפרטורת החדר כדי להגביל את התפשטות התרבית. לדגור את צלחות אגר ב 37 ° C אירובית במשך הלילה.
6. הכנת החיסון בתרסיס של הזן המתחרה לבדיקה
- הכינו את תרבות הלילה כמתואר בסעיף 4. לדלל את תרבית הלילה פי 10 במרק BHI כדי להניב כ 4 x 106 יחידות יוצרות מושבה (CFU) ml-1 ותרחיף של OD600 0.3 ±0.05.
הערה: דילול פי 10 לא ייתן 4 x 106 CFU ml-1 לכל מיני החיידקים, חשב את גורם הדילול הדרוש על ידי פיזור ציפוי דילול סדרתי בין 1 x 10-1-1 x 10-6.
- יוצקים את התרבית המדוללת לבקבוק וופורייזר בושם סטרילי מפלסטיק.
הערה: הנפח הכולל חייב להיות גדול מהנדרש למספר צלחות האגר המרוססות. כ-250 מיקרוליטר לצלחת מתאים לצלחת פטרי בקוטר 9 ס"מ.
7. בדיקת עיכוב גדילה נדחית
- רססו את התרבית דרך כל אחד מבקבוקי הוופורייזר כדי לוודא שהתרבית נטענת במנגנון הריסוס לפני הריסוס על האגר.
- ממרחק של כ-15 ס"מ מעל האגר, רססו כ-250 מיקרוליטר תרבית מדוללת (3 תרסיסים של וופורייזר טיפוסי של 50 מ"ל) על כל משטח האגר. לדגור את צלחות אגר ב 37 ° C אירובית במשך הלילה. חזור על הפעולה עבור צלחות אחרות עם אותו מספר תרסיסים.
8. פירוש תוצאות בדיקת עיכוב גדילה נדחית
- מדדו את אזור עיכוב הגדילה של הזן המתחרה המרוסס (איור 1A-C, "X" עד "X") במילימטרים, תוך הפחתת קוטר הנקודה המרכזית של המעכב-יצרן (איור 1A-C, "Y" עד "Y").
הערה: איור 1E מראה כיצד ניתן להציג נתונים אלה
- רשום את ציון הבהירות עבור אזורי עיכוב.
הערה: זה מצביע על מידת העיכוב שנצפה. דוגמאות מוצגות באיור 1A-D, זנים שיכולים לשמש לתקינה מוצעים בסעיף התוצאות המייצגות. ניתן להשתמש בסולם הבא לניקוד בהירות: ציון בהירות של 0 כדי לתאר אזור של עיכוב מוחלט של צמיחת הזן המתחרה. ציון 1 מתאר אזור של עיכוב כמעט מוחלט של הצמיחה, כאשר רק מושבות בודדות נמצאות באזור הטיהור. ציון 2 מתאר אזור נראה לעין של צמיחה מופחתת, הצמיחה בתוך אזור זה היא שוטפת או קרובה למפגש אך מופחתת בצפיפות ב ->50%. ציון 3 מתאר ירידה מינימלית בלבד בצמיחה, הצמיחה שוטפת ומופחתת בפחות מ-50%, ואזור עדיין גלוי ומדיד. ציון 4 אינו מתאר עיכוב נראה לעין של צמיחה. ציון 5 מתאר כי גדילת הזן המתחרה גדלה בקרבת הזן המייצר מעכבי בדיקה. ראו איור 1 לדוגמה. ציונים אלה הם סובייקטיביים עבור הנסיין.
