בדיקה לכימות סלמונלה ציטוסולית וסלקולארית במקרופאגים ראשוניים נגועים

תקציר

מקור: Meunier, E., et al. כימות של סלמונלה ציטוסולית לעומת Vacuolar במקרופאגים ראשוניים על ידי חדירות דיפרנציאלית. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים בדיקה לכימות ציטוסולי וסלמונלה טיפימוריום בתוך מקרופאגים שמקורם במח עצם באמצעות חדירה דיפרנציאלית. המקרופאגים נגועים בסלמונלה המבטאת חלבון פלואורסצנטי, המופנמת בתוך מבנה כלי דם מיוחד הנקרא ואקואול המכיל סלמונלה או SCV. תת-קבוצה של חיידקים בורחת מה-SCV ונכנסת לציטוזול. קרום הפלזמה העשיר בכולסטרול של המקרופאגים חדור באמצעות דיגיטונין, ומשאיר את ה- SCV שלם. לאחר תיוג החיידקים הציטוסוליים עם נוגדן מתויג פלואורסצנטית, אחוז החיידקים vacuolar ו cytosolic מכומת באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS).

פרוטוקול

1. בדיקת דיגיטונין עם סלמונלה המבטאת mCherry (ניתוח מבוסס FACS)

1. הכנת חיידקים
   הערה: סלמונלה מסוג בר SL1344 (עמיד סטרפטומיצין) המבטא mCherry מפלסמיד (pFPV קידוד mCherry תחת מקדם rpsM) משמש בבדיקה זו. פגוציטוזה חיידקית והתפשטות לא השתנו על ידי הביטוי המכונן של mCherry (הנתונים לא מוצגים).
   1. יש לחסן את הזן יום אחד לפני ההדבקה ב-3 מ"ל של LB בינוני בתוספת סטרפטומיצין (90 מק"ג/מ"ל) ואמפיצילין (100 מק"ג/מ"ל, וקטור המבטא mCherry) בשייקר ב-37°C O/N.
2. ציפוי תאים לזיהום.
   1. זרעו BMDMs מסוג בר בצלחת 24 בארות בצפיפות של 1.25 x 10⁵ תאים/באר ב-1 מ"ל של מדיום מקרופאגים ראשוני (DMEM בתוספת 10% סרום עגל עוברי (FCS, מומת חום, 56°C, 30 דקות), 1% 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיןאתאן-חומצה סולפונית (HEPES), 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 1% L-גלוטמין ו-10% L929 סופרנאטנט (תווך מותנה מגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) המייצר תאי L929). בארות זרעים לפי טבלה 1 מתייחסות לתנאים הבודדים. הוסף פתקי כיסוי לבארות המשמשות כפקדים (טבלה 1).
   2. לדגור על התאים במשך הלילה באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2.
3. הכנת החיידקים לזיהום.
   1. למחרת, לקבוע את ריכוז הסלמונלה בתרבית הלילה על ידי דילול התרבית 1:10 במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ומדידת OD₆₀₀ מול בקרת PBS בלבד. פעולה זו מבטיחה שה-OD₆₀₀ יימדד בטווח הליניארי של הספקטרופוטומטר.
   2. חישוב ריכוז הסלמונלה למ"ל. OD₆₀₀ של 1 מתאים 1 x 10⁹ חיידקים.
   3. לדלל את החיידקים בתווך מקרופאגים כדי להגיע לריכוז סלמונלה של 1.25 x 10⁶ תאים/מ"ל.
4. זיהום של תאים עם סלמונלה.
   1. הסר מדיום מ- BMDM. הוסף 1 מ"ל של מדיום מקרופאגים לבארות בקרה לא נגועות (B1-B3, C1-C3). הוסף 1 מ"ל של תרחיף סלמונלה לבארות A1 - A5 כדי להגיע לריבוי זיהום (m.o.i.) של 10 חיידקים לתא.
   2. צנטריפוגה את הצלחת במשך 15 דקות ב 300 x גרם ב 37 ° C כדי לסנכרן את הזיהום. מעבירים את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
5. הריגת סלמונלה חוץ-תאית עם גנטמיצין.
   1. שעה לאחר ההדבקה, הסר את הצלחת מהאינקובטור והוסף 0.1 מ"ל של מדיום מקרופאגים המכיל 0.1 מ"ג / מ"ל Gentamicin להרוג חיידקים תאיים. הוסף ג'נטמיצין לכל הבארות, אפילו לבקרות לא נגועות, כדי להבטיח שכל התאים מטופלים באותו אופן. מעבירים את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
6. שטיפת התאים.
   1. שעתיים לאחר ההדבקה, הסר את הצלחת מהאינקובטור ושטוף את כל הבארות 2x עם 1 מ"ל של DMEM רגיל (מחומם מראש ל 37 ° C) והחלף אותו עם מקרופאג בינוני (מחומם מראש ל 37 ° C) המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל Gentamycin כדי למנוע את הצמיחה של כל חיידקים תאיים שנותרו. מעבירים את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
7. הכנת מאגרים טריים עם דטרגנטים ונוגדנים.
   1. רגע לפני נקודת הזמן הרצויה של האנליזה, הכינו תמיסת מלאי טרייה של דיגיטונין במינון 1 מ"ג/מ"ל במאגר KHM (110 מ"מ אשלגן אצטט, 20 מ"מ HEPES, 2 מ"מ MgCl₂, pH 7.3). מסננים את הציר ומדללים במאגר KHM לריכוז עבודה של 50 מיקרוגרם/מ"ל דיגיטונין. בנוסף, הכינו תמיסה של 0.1% סאפונין ב-KHM Buffer, נוגדן נגד סלמונלה המצומד לפלואורסצאין איזותיוציאנט (CSA-1-FITC) ב-1/500, אנטי-קלנקסין ב-1/100 או איזומראז דיסולפיד אנטי-חלבוני (אנטי-PDI) ב-1/100 ב-KHM Buffer בתוספת אלבומין בסרום בקר 3% (BSA).
8. חלחול תאים.
   1. מוציאים את הצלחת מהאינקובטור ושוטפים בארות 3x עם 0.5 מ"ל של KHM Buffer (מחומם מראש ל 37 ° C). הסר את מאגר KHM והוסף חיץ KHM רגיל 0.25 מ"ל לבארות A4 ו- B1/C1, חיץ KHM עם דיגיטונין לבארות A1 - A3 ו- B2/C2, או חיץ KHM עם סאפונין לבארות A5 ו- B3/C3 (לפי טבלה 1). לדגור בדיוק 1 דקות ב RT ומיד לשטוף את כל הבארות 3x עם 0.5 מ"ל של KHM Buffer (מחומם מראש ל 37 ° C).
9. צביעת נוגדנים ראשונית.
   1. הסר את מאגר KHM והוסף את תמיסות הנוגדנים הראשוניות (עיזים נגד סלמונלה-FITC, 250 מיקרוליטר/באר, 0.1 מיקרוגרם/מ"ל) לבארות המתאימות (איור 1, טבלה 1). לדגור על הצלחת במשך 15 דקות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO₂.
   2. לשטוף את התאים 1x עם 1 מ"ל PBS.
10. תאים נגועים (בארות A1 - A5): ניתוח FACS
    1. יש לשטוף תאים 3x עם PBS ולהוסיף 0.5 מ"ל של PBS קר כקרח המכיל 0.1% טריטון. מעבירים לצינור FACS של 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים כדי לפרק את צברי התאים. יש לשמור את הדגימות על קרח.
    2. נתח את הדגימות של FACS. באמצעות הפקדים החדירים-במלואם, הגדר תחילה את השער לסך החיידקים בהתבסס על פיזור קדימה וצידי (FSC/SSC), ועל אות mCherry (מסנן 610 ננומטר ±-20 ננומטר).
    3. לאחר מכן, נתחו את אות ה-FITC באוכלוסיית החיידקים הכוללת באמצעות בקרות חדירות במלואן ולא חדירות כדי לקבוע את השערים עבור חיידקים ציטוסוליים (FITC+, mCherry+) וחיידקים ואקולריים (FITC-, mCherry+) (איור 2).
    4. עם הגדרת השערים, נתחו את הדגימות וקבעו את אחוז החיידקים הציטוסוליים לעומת הוואקולרים באמצעות תוכנת FlowJo בהתאם לפרוטוקול היצרן.

טבלה 1: ערכת ציפוי למקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM) בפורמט של 24 בארות להדבקה לאחר מכן בסלמונלה, חלחול וצביעה.

		Permeabilization		צביעה
	כיסוי זכוכית	סלמונלה	דיגיטונין	ספונין	נגד סלמונלה	אנטי-קלנקסין	אנטי-PDI
A1 (מדגם)	-/+*	+	+		+
A2 (מדגם)	-/+*	+	+		+
A3 (מדגם)	-/+*	+	+		+
A4 (ללא בקרת חלחול)	-/+*	+			+
A5 (בקרת חלחול מלאה)	-/+*	+		+	+
B1 (מוכתם בקלנקסין)	+					+
B2 (מוכתם עבור calnexin)	+		+			+
B3 (מוכתם בקלנקסין)	+			+		+
C1 (מוכתם עבור PDI)	+						+
C2 (מוכתם עבור PDI)	+		+				+
C3 (מוכתם עבור PDI)	+			+			+

תוצאות

איור 1. ייצוג סכמטי של פרוטוקול 1. תאים נגועים המכילים סלמונלה חיובית mCherry, או vacuoles שלמים או cytosol, הם permeabilized באופן דיפרנציאלי עם digitonin. סלמונלה ציטוסולית מוכתמת באנטי-סלמונלה המשולבת ל-FITC. התאים נשטפים ועוברים ליזה עם Triton X-100 לצורך ניתוח FACS. תאי בקרה שליליים אינם חדירים, בעוד תאי בקרה חיוביים הם חדירים לחלוטין לפני צביעת נוגדנים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דיגיטונין	סיגמא	D5628	50 מ"ג/מ"ל
פיפ"א	MPBIO	219998380
HEPES	לייף טכנולוגיות	15630
אשלגן אצטט	סיגמא	791733
MgCl2	סיגמא	M8266
BSA	סיגמא	A2153
נגד סלמונלה CSA-1-FITC	KPL	01-91-99-מ"ג	1/500
נגד סלמונלה CSA-1	KPL	02-91-99-מ"ג	1/500
אנטי-קלנקסין	אנצו מדעי החיים	SPA-860D	1/100
אנטי-PDI	אנצו מדעי החיים	ספא-890	1/100
ספונין	סיגמא	47036
בינוני הרכבה Vectashield	Vectorlabs	H-1200
נוגדן נגד ארנב-488	בדיקות מולקולריות	A-11070	1/500
גנטמיצין	לייף טכנולוגיות	15710-49	100ug/mL ו-10ug/mL
טריטון X-100	פרומגה	H5141
PBS	גיבקו	20012-019
DMEM	סיגמא	D6429
NEAA	אמיד	5-13K00-H
FACS פורטסה	טכנולוגיות BD		זיהוי mCherry 610 ננומטר
FACS פורטסה	טכנולוגיות BD		זיהוי FITC 530 ננומטר