כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. הכנת חיץ לאיסוף דם אנושי ובידוד טסיות שטף
- הכינו תמיסה מימית של 100 מ"ל של חומצה-ציטראט-דקסטרוז (ACD) על ידי המסת 1.4 גרם מונוהידראט חומצת לימון (C6H8O7•H2O, 66.6 מילימול), 2.5 גרם טריסודיום ציטראט דיהידרט (Na3C6H5O7•2 H2O, 85 mM) ו-2 גרם D(+)-גלוקוז נטול מים. ה- pH של הפתרון הוא כ 4.5.
- הכן פתרונות מלאי עבור החיץ של Tyrode באופן הבא
- הכינו תמיסת מלאי 1 על ידי המסת 80 גרם נתרן כלורי (NaCl), 2 גרם אשלגן כלורי (KCl), 10 גרם סודיום ביקרבונט (NaHCO3), ו-0.58 גרם נתרן דימימן פוספט מונוהידרט (NaH2PO4*H2O) ב-500 מ"ל H2O מזוקק. הריכוזים הסופיים בהתאמה הם 2.73 M, 53.6 mM, 238 mM ו-8.4 mM. שמור את התמיסה על 4 ° C.
- הכינו תמיסת מלאי 2 על ידי המסת 10.15 גרם מגנזיום דיכלוריד הקסהידראט (MgCl2*6 H2O) (100 מילימול) במים מזוקקים של 500 מ"ל (H2O). שמור את התמיסה על 4 ° C.
- הכן תמיסת מלאי 3 על ידי המסת 10.95 גרם (100 מ"ר) סידן כלורי הקסהידראט CaCl2*6 H2O ב 500 מ"ל מזוקק H2O. שמור את התמיסה על 4 ° C.
- הכינו את החיץ של Tyrode על ידי דילול 2.5 מ"ל של תמיסת מלאי 1 בנפח סופי של 50 מ"ל עם H2O מזוקק. זה מתאים לריכוזים סופיים של 136.5 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 11.9 mM NaHCO3 ו- 0.42 mM NaH2PO4*H2O. התאם את ה- pH ל- 7.35 וחטא על ידי סינון עם מסננים של 0.22 מיקרומטר.
- הכינו את מאגר האלבומין 0.35% של Tyrode (מאגר TA) על ידי דילול 5 מ"ל של תמיסת מלאי 1, 1 מ"ל של תמיסת מלאי 2, 2 מ"ל של תמיסת מלאי 3, 0.5 מ"ל 1M HEPES, 1.8 מ"ל של אלבומין בסרום אנושי של 200 גרם/ליטר ו-0.1 גרם של D(+)-גלוקוז נטול מים בנפח סופי של 100 מ"ל מזוקק H2O.
- כוונן את ה- pH ל- 7.35 עם חומצה הידרוכלורית 1N (HCl) והגדר את האוסמולריות ל- 295 mOsm/L על ידי הוספת H2O מזוקק (10% מהנפח הכולל). הריכוזים הסופיים בתמיסה זו הם 124 mM NaCl, 2.44 mM KCl, 10.82 mM NaHCO3, 0.38 mM NaH2PO4*H2O, 0.91 mM MgCl2*6 H2O, 1.82 mM CaCl2*6 H2O. שמור על מאגר TA בטמפרטורה של 37°C במהלך כל הניסוי.
2. איסוף דם
- לאסוף 45-50 מ"ל של דם ורידי, מן הווריד antecubital באמצעות מחט 19 G ולא חוסם עורקים נמוך, לתוך צינורות 50 מ"ל המכילים נוגד קרישה ACD (1 נפח ACD עבור 6 כרכים של דם). להשליך את הראשון 1-2 מ"ל של דם כדי למנוע נוכחות של טרומבין גורם רקמות.
- לאחר האיסוף, מערבבים את הדם עם ACD על ידי היפוך עדין של הצינור. לדגור את הדגימה במשך 10 דקות ב 37 ° C.
3. הכנת טסיות דם שטופות אדם
- מחממים מראש את הצנטריפוגה ל 37 מעלות צלזיוס. כל שלבי הצנטריפוגה להלן מבוצעים בטמפרטורה זו.
- שלח את הדם שנאסף לתוך צינורות 15 מ"ל (5 מ"ל לכל צינור) וצנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 13 דקות כדי לקבל פלזמה עשירה טסיות, PRP.
הערה: שלב צנטריפוגה זה גורם לייצור שלוש שכבות בדגימה: 1) השכבה העליונה, המורכבת מפלזמה, טסיות דם וחלק קטן של תאי דם לבנים. 2) שכבת הביניים, חלק עשיר בתאי דם לבנים. 3) השכבה התחתונה, המורכבת למעשה מתאי דם אדומים.
- לאסוף את PRP על ידי pipeting את השכבה העליונה בזהירות לתוך צינור חדש 15 מ"ל כדי למנוע זיהום מקסימלי עם תאי דם אדומים ולבנים, לדגור במשך 10 דקות ב 37 ° C.
- צנטריפוגה PRP ב 2,200 x גרם במשך 12 דקות (עבור 5 מ"ל PRP).
הערה: שלב צנטריפוגה זה צריך להתבצע עם בלם נמוך או ללא בלם.
- הסר את הסופרנאטנט (פלזמה ענייה בטסיות), והשהה בזהירות את הגלולה עם 10 מ"ל של חיץ TA המכיל 2 μL/mL של הפרין (5,000 U/mL) ו- 2.5 μL/mL של 25 μM prostacyclin (PGI2) באמצעות פיפט פסטר מפלסטיק. לדגור במשך 10 דקות ב 37 ° C.
- הוסף 2.5 μL/mL של 25 μM prostacyclin-I2 (PGI2) וצנטריפוגה למשך 8 דקות ב- 1,900 x g (עם בלימה נמוכה או ללא בלם).
- הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה עם חיץ 5 מ"ל TA המכיל 2.5 μL/mL של 25 μM PGI2 באמצעות פיפט פסטר מפלסטיק. לדגור במשך 10 דקות ב 37 ° C.
- במהלך תקופת הדגירה, צינור 150 μL של תרחיף טסיות לתוך צינור 1.5 מ"ל ולספור טסיות, באמצעות מונה תאים אוטומטי (המזהה את גודל תאי הדם על ידי מדידת השינויים בהתנגדות זרם ישיר).
- לאחר הדגירה של 10 דקות, הוסף 2.5 μL/mL של 25 μM PGI2 למתלה הטסיות ומיד צנטריפוגה במהירות של 1,900 x גרם למשך 8 דקות.
- הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה לריכוז של 250,000 טסיות/μL עם נפח מתאים של חיץ TA (כלומר, אם ספירת התאים היא 500,000 למיקרוליטר, השהה מחדש במאגר TA של 10 מ"ל) המכיל 32 μL/mL של אפיראז ב- 0.01 U/mL (ריכוז סופי 0.32 U/mL).
הערה: ריכוז גבוה של אפיראז משמש כדי למנוע את desensitization של P2X purinoceptor 1, קולטני P2X1 המושרה על ידי הפרשה ספונטנית של אדנוזין טריפוספט (ATP) בהיעדר אגוניסטים. זה חשוב כי תגובות המושרות על ידי קולגן מושרות על ידי הפעלה מהירה של פרקרינית/אוטוקרינית של P2X1 על ידי ATP המשתחרר מטסיות דם פעילות. אם מסלול איתות הטסיות אינו דורש באופן קריטי שימור של פונקציית P2X1, השתמש ב- 0.02 U/mL apyrase. מספר מחקרים הראו כי 0.02 U/mL apyrase נמנע אדנוזין דיפוספט ADP קולטן P2Y purinoceptor 1, ו P2Y1 desensitization עם תגובות P2X1 זניח.
- לדגור על תרחיף התא לפחות 30 דקות ב 37 ° C לפני ביצוע המדידות אגרגומטריות. ההכנה יציבה למשך 5 עד 8 שעות.
4. אגרגומטריה
- הכינו פיברינוגן (56 מ"ג/מ"ל) במאגר של טירוד.
- פיפט 260 μL של תרחיף טסיות לתוך קוביות זכוכית (איור 1A; קובטה שמאלית) המכילות 10 μL של פיברינוגן (56 מ"ג/מ"ל) ומוט ערבוב מגנטי, ואז דוגרים על התרחיף במשך 2-3 דקות ב-37°C בבארות הדגירה שנמצאות באגרגומטר (איור 1B ו-1C).
- יש לדגור מראש עם מעכב Panx1 Brilliant Blue FCF על ידי הוספת 10 μL של תמיסת מלאי של 2.8 מילימטר או 28 מילימטר (ריכוז סופי של 100 מיקרומטר ו-1 מילימול, בהתאמה) למשך 7 דקות ב-37°C.
- כייל את מד האגרגומטר לערך צבירה משוער של 100% על ידי מדידת הצפיפות האופטית (OD) של קובטה המכילה פיברינוגן 10 μL (56 מ"ג/מ"ל), 10 μL Brilliant Blue FCF (2.8 מילימטר או 28 מילימול) וחיץ TA ללא טסיות.
- מקם את הקובט בצבירה היטב תחת ערבוב אוטומטי ולחץ על הלחצן המתאים במקלדת המחשב המקושר לאגרגומטר (כלומר, הקש F1 אם נעשה שימוש בצבירה באר 1).
הערה: ניסוי זה המתואר להלן כולל את Brilliant Blue FCF. יש להתאים את התרכובת המשמשת לכיול למצב הניסוי.
- כיילו את מד האגרגומטר לערך צבירה מניח של 0% על ידי שימוש באותה דגימת טסיות שתשמש לניסוי תחת ערבוב אוטומטי.
- מקם את cuvette באר צבירה ולחץ על הכפתור המתאים על המקלדת של המחשב המקושר aggregometer. המתן כ 20-30 שניות לפני שתמשיך. עיכוב זה משמש כדי להבטיח שלא תתרחש צבירה לפני הוספת האגוניסטים.
הערה: מכיוון שכל הבדל במספר טסיות הדם עשוי להשפיע על ה-OD הנמדד, יש לחזור על שלב הכיול של 0% עבור כל מדידה בנפרד.
- הוסף 20 μL של אגוניסט הרצוי, כגון 15 מיקרוגרם / מ"ל קולגן (1 מיקרוגרם / מ"ל סופי) או 1.125 mM חומצה ארכידונית (75 מיקרומטר סופי), לתוך cuvette. התחל מיד את ההקלטה תחת ערבוב אוטומטי מתמשך על ידי לחיצה על הלחצן המתאים במקלדת המחשב המקושר aggregometer.
הערה: תוספת האגוניסט גורמת להפעלת טסיות. ניתן להבחין בבירור בצברי טסיות בקובט הזכוכית בסוף הניסוי (איור 1A; קובטה ימנית).
- ההקלטה נפסקת אוטומטית לאחר 6 דקות. בשלב זה, שמור את הנתונים על ידי לחיצה על סמל השמירה במחשב.
הערה: חישוב שיעור הצבירה מתבצע על ידי המחשב, המבטא את התוצאות הסופיות של תהליך הצבירה באחוזים.
