הערה: כל השלבים המתוארים בסעיפים 1 ו-2 מתבצעים בתנאים סטריליים בארון זרימה למינרי.
1. תחזוקה של U87. תאי CD4.hCXCR4
- לגדל את התאים בצלוחיות תרבית T75 בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 באינקובטור לח.
הערה: קו התאים במבחנה המשמש בפרוטוקול זה הוא קו תאי גליובלסטומה U87 המבטא ביציבות אשכול התמיינות 4 (CD4) וקולטן כימוקין CXC אנושי 4 (CXCR4) ותואר בעבר. ביטוי פני השטח של התא של CD4 ו- CXCR4 מנוטר ברציפות על ידי ציטומטריית זרימה ורמות הביטוי נשארות קבועות לאורך זמן (~ 100% CD4+ ו~ 100% CXCR4+ תאים). תיאור מפורט של יצירת קו התאים המשומש ושל הליך ציטומטריית הזרימה לחקר רמות ביטוי הקולטן אינו במסגרת פרוטוקול זה.
- תאי תת-תרבית במפגש של 80-85%. אפשר לכל הריאגנטים להגיע לטמפרטורת החדר (RT) לפני תרבית תאים.
- הסר את מדיום התרבית המותנה מהתאים ושטוף את חד-שכבת התא פעם אחת עם 5 מ"ל מלח חוצץ פוספט (PBS).
- הוסף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין-אתילאנדיאמין חומצה טטראצטית (טריפסין-EDTA) ולהפיץ אותו באופן שווה על monolayer התא. לאחר מכן להסיר את עודף טריפסין-EDTA ולדגור עד 5 דקות ב 37 ° C עד התאים מתחילים להתנתק.
- הוסף 10 מ"ל של מדיום צמיחה מלא טרי (מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) + 10% סרום בקר עוברי (FBS) + 0.01 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) + סוכני בחירה מתאימים). השהה מחדש את התאים על ידי פיטופ עדין שלהם למעלה ולמטה. מעבירים את מתלה התא לצינור סטרילי של 50 מ"ל.
- ספור את מספר התאים בני קיימא באמצעות שיטה לבחירה. במקרה של תאי גליובלסטומה U87, הכדאיות מגיעה בדרך כלל ל~ 100%.
הערה: ניתן לקבוע מספרי תאים במספר דרכים. אנו משתמשים באופן שגרתי במערכת אוטומטית לניתוח תאים המבוססת על צביעה כחולה טריפאן (ראו טבלת חומרים) בהתאם לנוהלי הטיפול הסטנדרטיים שלה, אך אופנים אחרים אמורים לעבוד באותה מידה.
- הוסף 2 x 10,6 או 3 x 10,6 תאים (קיימא) לנפח סופי של 25 מ"ל מדיום גידול טרי בבקבוק תרבית T75 ודגור ב 37 ° C ו 5% פחמן דו חמצני (CO2).
הערה: אם 3 x 106 תאים משמשים, התאים יגיעו 80-90% מפגש לאחר 2 ימים. אם 2 x 106 תאים משמשים, הם יגיעו לאותו מפגש לאחר 3 ימים. קצב הגדילה של התאים צריך להיקבע תחילה באופן אמפירי אם נעשה שימוש בקווי תאים אחרים.
2. זריעת התאים לבדיקת הניוד Ca2+
- ביום מעבר התאים (יום 0), צפו לוחות פוליסטירן בעלי דופן שחורה 96 בארות עם תחתית שקופה (ראו טבלת חומרים) בתמיסת ג'לטין 0.1% כדי להקל על חיבור התא.
הערה: ציפוי של צלחות 96 בארות בג'לטין עשוי להיות מושמט אם נעשה שימוש בלוחות מצופים מראש, הזמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים). מומלץ להעריך את השימוש בצלחות מצופות מראש במקום ציפוי ידני לכל קו תאים הנחקר לפני המשך הפרוטוקול.
- הכן תמיסת ג'לטין על ידי הוספת 1 גרם ג'לטין ל- PBS של 100 מ"ל לקבלת תמיסה של 1%. יש לדלל פי 10 עם PBS לפני שימוש נוסף. כדי לשפר את המסיסות של ג'לטין, לחמם את הפתרון ל 37 ° C.
- הוסף 100 μL של תמיסת ג'לטין 0.1% לכל באר של צלחת 96 באר באמצעות פיפטה רב ערוצית. דגירה במשך שעתיים ב- RT.
- בינתיים, להכין את התאים לזריעה בצלחת מצופה 96 בארות.
- מנתקים את התאים מבקבוק התרבית, משעים אותם מחדש במצע הגידול הטרי וסופרים אותם בשיטת הצביעה הכחולה טריפאן.
- סובב את התאים בצינור של 50 מ"ל למשך 5 דקות ב- 400 x גרם ב- RT.
- להשהות מחדש את התאים במדיום גידול טרי (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, ללא אנטיביוטיקה) כדי לקבל צפיפות תאים של 0.1 x 106 (קיימא) תאים / מ"ל.
- הסר את תמיסת הג'לטין מהלוחות בעלי הדפנות השחורות עם תחתית שקופה על ידי היפוך הצלחת וייבוש על רקמה. מוסיפים 200 μL/well PBS כדי להסיר עודפי ג'לטין והופכים שוב את הצלחת.
- יש לוותר על 200 μL של תרחיף התא (המקביל ל-0.2 x 105 תאים) לכל באר בצלחת 96 בארות מצופת ג'לטין (מעתה צלחת זו תיקרא גם "צלחת המדידה").
- יש לדגור על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ו-5% פחמן דו-חמצני (CO2).
3. העמסת התאים בצבע פלואורסצנטי Ca2+ רגיש
- ביום הראשון בצעו את בדיקת הניוד בפועל של Ca2+, החל מהעמסת תאי הזרעים עם הצבע הקושר Ca2+ פלואורסצנטי fluo-2 אצטוקסימתיל (fluo-2 AM).
- הכינו את חיץ הבדיקה על ידי הוספת 40 מ"ל HEPES (1 M) עד 200 מ"ל תמיסת מלח מאוזנת של Hank (HBSS, 10x, ללא פנול אדום, ללא סודיום ביקרבונט). הוסיפו מים אולטרה-טהורים לקבלת נפח סופי של 2 ליטר והוסיפו 4 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA). יש להמיס את ה-BSA באמצעות ערבוב מגנטי. התאם את ה- pH ל- 7.4 (עם נתרן הידרוקסידי, NaOH) וסנן את התמיסה.
הערה: במהלך כל השלבים הבאים נעשה שימוש באותו מאגר, המכונה "מאגר מבחן".
- הכינו תמיסת ציר (4 מילימטר בדימתיל סולפוקסיד (DMSO)) של הצבע הפלואורסצנטי Ca2+ הרגיש fluo-2 AM. יש להימנע מחשיפה מוגזמת לאור. יש להמיס 1 מ"ג fluo-2 AM (משקל מולקולרי: 1,061 גרם/מול) ב-235.6 μL DMSO.
- הכן פתרון עבודה של fluo-2 AM. עבור תמיסת צלחת בדיקה אחת של 96 בארות 12.5 μL של תמיסת מלאי fluo-2 AM (4 mM) ותמיסת 12.5 μL nonionic surfactant polyol (למשל, f-127 פלורוני) (20% משקל/נפח ב- DMSO, ראה טבלת חומרים). הוסף 22 μL של תערובת זו למאגר בדיקה של 11 מ"ל בצינור של 15 מ"ל. הריכוז הסופי של fluo-2 AM הוא 4 μM.
הערה: חומר פעילי השטח הלא-יוני משמש כחומר פיזור לשיפור המסיסות המימית של fluo-2 AM וכתוצאה מכך לשיפור עומס התאים. כדי להמיס את חומר פעילי השטח ב-DMSO, חממו את הדגימה ב-37°C וערבבו באופן קבוע כדי לקבל תמיסה הומוגנית.
- הסר את מצע הגידול מהתאים שנזרעו בעבר בצלחת המדידה של 96 בארות על ידי היפוך הצלחת וייבוש על מגבת נייר.
- הוסף 100 μL של תמיסת צבע העמסה לכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית ודגור במשך 45 דקות ב- RT בחושך.
4. הכנת לוחות פוליפרופילן 96 בארות המכילות את ליגנד הכימוקין ליגנד CXC 12 (CXCL12) או את התרכובות הנחקרות
- השג לוחות פוליפרופילן בעלי תחתית עגולה (PP) בעלת 96 בארות (ראה טבלת חומרים).
- אפשר לתמיסת המלאי של CXCL12 (1 מ"ג/מ"ל) ולתמיסת המלאי של התרכובות הנחקרות להתאזן ב-RT.
הערה: תמיסת המלאי של CXCL12 מוכנה במים טהורים במיוחד בתוספת 0.01% Tween20 ומאוחסנת ב -20 °C כאליציטוטים חד-פעמיים.
- הכינו תמיסה מרוכזת פי 5 של CXCL12 במאגר בדיקה (250 ננוגרם/מ"ל השווה ל-31.25 ננומטר) ודילול מרוכז פי 5 של כל תרכובת (במאגר מבחן).
- חלק את פתרונות המלאי לצלחת המתאימה בעלת 96 בארות בהתאם לפריסת צלחת מוגדרת מראש. יש להוציא 75 μL/well בצלחת המכילה CXCL12 ("צלחת הכימוקין"), ולהוציא 50 μL/well בצלחת המכילה את התרכובות ("צלחת התרכובת").
הערה: שתי התרכובות ו-CXCL12 ידוללו לבסוף פי 5 עם ניפוקן בלוח המדידה. חשוב גם לכלול בארות בקרה שליליות המכילות רק חיץ בדיקה הן בצלחת התרכובת והן בצלחת הכימוקין. כמו כן, יש לכלול בארות בקרה חיוביות (כלומר, בארות עם CXCL12 בצלחת הכימוקין, אך עם חיץ בדיקה בבארות המתאימות של הצלחת המורכבת).
5. הגדרות פרוטוקול בקורא Microplate פלואורסצנטי
הערה: קורא המיקרו-לוחות הפלואורסצנטיים המשמש בפרוטוקול זה מוזכר בטבלת החומרים.
- הפעל תחילה את יחידת הקירור של קורא לוחות הפלואורסצנטיות ולאחר מכן הפעל את קורא הפלואורסצנטיות עצמו. תן ליזום במשך כמה דקות ולפתוח את תוכנת המערכת.
- צור את פרוטוקול הבדיקה באמצעות תפריט גרירה ושחרור הכולל את השלבים הבאים:
- בתיבה "הגדרות", בחר 'Read_Mode' עם אורך גל עירור: 470-495 ננומטר; ואורך גל פליטה: 515-575 ננומטר.
הערה: אורכי הגל שנבחרו מתאימים לשימוש עם צבע רגיש Ca2+ fluo2.
- כלול את התיבה "Mix with TF" (נוזל העברה) לערבוב אוטומטי של התרכובות בלוח התרכובת, אשר יוצב במקור 2 מיקומים של המכשיר (ראה שלב 6.4). בחר 15 μL של תמיסה בכל באר כדי להיות שואף באופן אוטומטי מעורבב שלוש פעמים. התאם את גובה קצות פיפטה ל 20 μL מתחת לפני השטח הנוזלי. הגדר את מהירות השאיפה והחלוקה על 50 μL/s.
הערה: גובה קצות הפיפטה מתייחס לנפח שנותר מתחת לקצות הפיפטה. לדוגמה, אם הבארות של צלחת מורכבת מכילות 50 μL, גובה של 30 μL מתאים ל -20 μL מתחת לפני השטח הנוזליים. ניתן לכוונן באמצעות התוכנה את נפח התמיסה המורכבת הנלקחת לערבוב, מהירות הערבוב, מיקום קצות הפיפטה במהלך הערבוב ומספר מחזורי הערבוב.
- בתיבה "נוזל העברה", הגדר כי 20 μL מכל באר מלוח המורכב יועברו ללוח המדידה. מקמו את קצות הפיפטה על 20 μL מתחת לפני השטח הנוזליים, כלומר בגובה של 30 μL במהלך שאיפת התרכובות ובגובה של 60 μL במהלך הניפוק בלוח המדידה. הגדר את מהירות השאיפה על 50 μL/s ואת מהירות הניפוק על 25 μL/s.
הערה: לוח התרכובת מכיל 50 μL של תמיסה לכל באר (ראה שלב 4.1.3), ולכן גובה של 30 μL מתאים למיקום 20 μL מתחת לפני השטח הנוזלי. לוח המדידה יכיל 80 μL של חיץ בדיקה לכל באר (ראה שלב 6.3), ולכן גובה של 60 μL מתאים למיקום דומה של הקצות.
- בחר את הלחצן "קרא עם TF". במהלך המרווח הראשון, בחר 60 קריאות (מדידות פלואורסצנטיות) עם מרווח קריאה של 1 שניות. הגדירו ש-10 קריאות נרשמות לפני חלוקת התרכובות ללוח המדידה, ו-50 קריאות לאחר מכן. הגדר את מרווח הזמן השני עם מרווח קריאה של 30 שניות ו- 18 קריאות.
הערה: במהלך שלב זה, פלואורסצנטיות תימדד באופן קינטי (במרווחי הזמן המוגדרים) במשך ~ 10 דקות בסך הכל.
- כלול את כפתור "טיפים לשטיפה" בפרוטוקול שלוש פעמים. בתוך כל שלב כביסה, בחר את סוג הנוזל: נוזל A (מים טהורים במיוחד) או נוזל B (70% אתנול), מספר מחזורי הכביסה (1), מהירות המשאבה (מהירה) ומספר הפעימות (5) במהלך כל שלב שטיפה.
הערה: במהלך שלב השטיפה הראשון והאחרון נוזל A משמש, במהלך שלב הכביסה השני נוזל B משמש.
- כלול את הפונקציה "Pause Pipettor". הגדר את הפיפטור להשהיה למשך 300 s.
הערה: על ידי הכללת שלב זה בפרוטוקול, ראש הפיפטור, המשולב במכשיר קורא לוחות הפלואורסצנציה, יושהה למשך 5 דקות לפני שימשיך בפרוטוקול.
- כלול את התיבה "ערבוב עם TF" כדי לאפשר ערבוב אוטומטי של תמיסת CXCL12 בלוח הכימוקין, אשר ימוקם במיקום המקור 3 של המכשיר (ראה שלב 6.4). בחר 15 μL של תמיסה בכל באר כדי להיות שואף באופן אוטומטי מעורבב שלוש פעמים. במהלך השאיפה והערבוב, מקמו את קצות פיפטה 20 μL מתחת לפני השטח הנוזלי. מהירות השאיפה והחלוקה נקבעת על 50 μL/s.
הערה: בדומה לשלב 5.2.2, ניתן להתאים פרמטרים אלה.
- בתיבה הבאה "נוזל העברה", הגדר כי 25 μL מכל באר של צלחת chemokine יועברו לתוך צלחת המדידה. קצות מיקום 20 μL מתחת לפני השטח הנוזליים, כלומר, בגובה של 55 μL במהלך שאיפה מצלחת chemokine המכילה 75 μL / באר (ראה שלב 4.1.3), ובגובה של 80 μL במהלך ניפוק בלוח המדידה. הגדר את מהירות השאיפה על 50 μL / s ואת מהירות הניפוק על 25 μL / s.
- כלול את הלחצן "קרא עם TF". במהלך מרווח הזמן הראשון, בחר 145 קריאות עם זמן מרווח קריאה של 1 שניות. הגדירו ש-5 קריאות נרשמות לפני הכנסת CXCL12 ללוח המדידה, ו-140 קריאות לאחר מכן. הגדר את מרווח הזמן השני עם מרווח קריאה של 6 שניות ובחר 20 reads.
הערה: יחד, לאורך כל הפרוטוקול נרשמות 243 קריאות (מדידות פלורסנט): 78 בשלב 5.2.4 ו-165 בשלב 5.2.9.
- בדומה לשלב 5.2.5, כלול את כפתור "שטף טיפים" שלוש פעמים בפרוטוקול.
הערה: הכללת שלב זה בסוף הפרוטוקול מאפשרת שימוש חוזר בטיפים לביצוע בדיקה נוספת ללא צורך לשנות את הטיפים.
- הגדר את טמפרטורת המכשיר על 37 °C על ידי לחיצה על כפתור "הגדר טמפרטורת במה" ובחירה 37 °C.
6. הפעלת בדיקת פלואורסצנטיות
- לאחר שלוח המדידה הודגר עם חיץ העמסה במשך 45 דקות (ראה שלב 3.1.5), הסר את המאגר על ידי היפוך הצלחת וייבוש על רקמה.
- שטפו את תאי הזרעים על ידי הוספת 150 מיקרוליטר / באר של חיץ הבדיקה ודגרו במשך 2 דקות.
- הסר שוב את המאגר על-ידי היפוך הצלחת. הוסף 80 μL / באר של מאגר הבדיקה עם פיפטה רב ערוצית.
- הכניסו את כל הצלחות למכשיר במיקום המתאים להן: הצלחת המורכבת במיקום מקור 2, צלחת הכימוקין במיקום מקור 3 ולוחית המדידה במיקום הקריאה. שים קופסה של טיפים שחורים במיקום המקור 1 טיפים. סגרו את דלת המכשיר ודגרו במשך 5 דקות לפני שתמשיכו בפרוטוקול.
- בחר בלחצן "בדיקת אות פרוטוקול" כדי לקבוע את יחידות האור היחסיות ברקע (RLU) ואת השונות הפלואורסצנטית מעל הלוח. חלון חדש יופיע. בחר "אות בדיקה".
הערה: במהלך שלב זה, RLUs ברקע נקבעים על ידי מצלמת התקן מצמיד טעינה מוגברת (ICCD), המשולבת בתא האופטיקה של התקן קורא הפלואורסצנטיות. RLUs אלה נובעים מעיור של צבע רגיש Ca2+ (fluo-2) על ידי דיודות פולטות אור (LED) (אורך גל פלט LED 470-495 ננומטר). ערכים של 8,000-10,000 RLUs מתאימים היטב ליישום זה. ניתן להתאים RLUs במידת הצורך על-ידי שינוי עוצמת העירור (Select Exc. Intensity), או שער המצלמה (Select Gate Open). השונות על הצלחת צריכה להיות באופן אידיאלי פחות מ -7.5%.
- בחר "עדכן" אם מתקבלים ערכי רקע של 8,000-10,000 RLU. שמור את הפרוטוקול הראשי על ידי לחיצה על להציל לחצן.
הערה: על ידי כך, ההגדרות מבדיקת אות הפרוטוקול יועברו לפרוטוקול הראשי.
- הפעל את הבדיקה על ידי לחיצה על כפתור "הפעל".
