מדידה חוץ גופית של פעילות האנזים α-גלקטוזידאז A וחומצה α-גלוקוזידאז

תקציר

מקור: Lukas, J., et al. מדידת אנזימי מבחנה לבדיקת היענות מלווה תרופתי במחלת פברי ופמפה. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים מדידה חוץ גופית של פעילות אנזימים עבור α-גלקטוזידאז A וחומצה α-גלוקוזידאז בדגימות באמצעות מצעים סינתטיים 4-Methylumbelliferyl.

פרוטוקול

1. קציר תאים ו-α-גלקטוזידאז A או חומצה α-גלוקוזידאז מדידת פעילות

1. קציר תאים
   1. ביום הקציר, להסיר את התאים מן האינקובטור ולשאוף את המדיום. בזהירות לשטוף את התאים 2 פעמים עם PBS עם Ca₂+ ו Mg₂ + .
      הערה: שלב זה הוא קריטי מכיוון ש- DGJ ו- DNJ הם מעכבים חזקים של α-גלקטוזידאז ו- α-גלוקוזידאז, בהתאמה, וכל שאריות יבטלו את הבדיקה.
   2. הוסף 200 μL של מים deionized ישירות על גבי התאים. שוטפים את התאים מהצלחת ומעבירים אותם לצינור תגובה של 1.5 מ"ל.

2. הומוגניזציה על ידי הקפאה והפשרה

1. שים את הדגימות במדף קצף מתאים מערבולת במשך 5 שניות כדי להפוך את הליזיס יעיל יותר. שים את הדגימות לסירוגין בחנקן נוזלי במשך 10 שניות ובאמבט מים בטמפרטורת החדר עד להשלמת ההפשרה (5 דקות).
2. חזור על הליך זה 5 פעמים ולאחר מכן סובב את הדגימות במשך 5 דקות ב 10,000 x גרם. שמור את supernatant ו pipette בצינור תגובה חדש.

3. קביעת ריכוז חלבון באמצעות בדיקת חומצה ביכומונית (BCA)

1. הכינו צינור טרי לכל דגימה המכיל 40 μL של H₂O שעבר דה-יוניזציה והוסיפו 10 μL של הדגימה. מערבבים את התמיסה על ידי ערבול קצר ומעבירים 10 μL לתוך חלל של צלחת באר 96 (כל דגימה משולשת). יש לדלל תמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) של 2 מ"ג/מ"ל ב-H₂O שעבר דה-יוניזציה באופן הבא כדי לקבל עקומה סטנדרטית: 50 μL H₂O/50 μL BSA; 60 μL H₂O/40 μL BSA; 70 μL H₂O/30 μL BSA; 80 μL H₂O/20 μL BSA; 90 μL H₂O/10 μL BSA; 100 μL H₂O.
2. התחל את התגובה על ידי הוספת 200 μL של מגיב BCA (מגיב A וריאגנט B מעורבב ביחס של 50:1) ודגור במשך שעה אחת בחושך ב 37 ° C תחת תסיסה קלה על שייקר מסלול (300 סל"ד). מדוד את הספיגה ב- 560 ננומטר בקורא לוחות.
   הערה: הדגימות מכילות בדרך כלל בין 1 ל-1.5 מיקרוגרם חלבון למיקרוליטר.

4. מדידת פעילות אנזימים עם סובסטרטים מלאכותיים 4-Methylumbelliferyl (4-MUG)

1. דללו את הכמות המחושבת של כל דגימה ופיפטה לצינורות תגובה טריים של 1.5 מ"ל כדי לקבל 0.05 (עבור α-גלקטוזידאז A) או 0.5 (עבור תמיסות חומצה α-גלוקוזידאז) מיקרוגרם חלבון/μL. מערבבים שוב את הדגימות במשך 5 שניות ומזרימים 10 μL של דילול זה לצלחת של 96 בארות (כל דגימה כפולה).
2. התחל את התגובה על ידי הוספת 20 μL של תמיסת המצע המתאימה:
   עבור α-גלקטוזידאז A: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside (4-MU-gal) ב-0.06 M פוספט ציטראט חוצץ, pH 4.7.
   עבור חומצה α-גלוקוזידאז: 2 mM 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) ב 0.025 M נתרן אצטט, pH 4.0.
3. לדגור על תגובות האנזים במשך שעה אחת בחושך ב 37 ° C תחת תסיסה קלה על שייקר מסלול (300 סל"ד). לסיים את התגובה על ידי תוספת של 200 μL של 1.0 M, pH 10.5 מותאם גליצין-NaOH חיץ מותאם.
4. הכן עקומה סטנדרטית של 4-methylumbelliferone (4-MU) ממלאי של 0.01 מ"ג/מ"ל באופן הבא:
   100 μL H2O / לא 4-MU; 80 μL H2O / 20 μL 4-MU; 60 μL H₂O/ 40 μL 4-MU; 40 μL H₂O / 60 μL 4-MU; 20 μL H₂O / 80 μL 4-MU; לא H₂O/ 100 μL 4-MU, פיפט 10 μL מכל דילול לתוך צלחת 96 באר (בכפילויות) ולהוסיף 200 μL של חיץ גליצין-NaOH 1.0 M לכל באר על מנת להתאים את נפח ו- pH.
5. מדוד את פעילות האנזים בקורא פלואורסצנטי המצויד בערכת המסננים המתאימה ונתח את הנתונים באמצעות התוכנה המתאימה להתקן קורא הפלואורסצנטי.
   הערה: שני מצעי 4-MUG מופחתים ל-4-MU במהלך חשיפה ל-α-galactosidase A או חומצה α-glucosidase. שוחרר 4-MU הוא פלואורוכרום, אשר ניתן למדוד ב 360 ו 465 ננומטר כמו עירור ופליטת אורכי גל, בהתאמה, באמצעות קורא פלואורסצנטי microplate.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נתרן כלורי	Merck, Darmstadt, גרמניה	1,06,40,41,000
פוטסיום כלוריד	Merck, Darmstadt, גרמניה	1,04,93,60,500
MgCl2 x 6H2O	Merck, Darmstadt, גרמניה	1,05,83,30,250
D (+)-גלוקוז מונוהידראט	Merck, Darmstadt, גרמניה	1,08,34,22,500
נתרן הידרוקסידי	Merck, Darmstadt, גרמניה	1,06,49,80,500
נתרן אצטט	Merck, Darmstadt, גרמניה	1,06,26,40,050
HEK293H קו התא	Invitrogen, Karlsruhe, גרמניה	11631-017
צינורות תגובה SafeSeal, 1.5 מ"ל	Sarstedt, Nümbrecht, גרמניה	72,706
Tecan GENios Reader	Tecan, Männedorf, שוויץ
תוכנת ניתוח נתונים מגלן v6.6	Tecan, Männedorf, שוויץ	נ.א.