הערכת היעילות של תרכובת בדיקה אנטי-ויראלית באמצעות בדיקת אינאקטיבציה ויראלית

1. בדיקת השבתה ויראלית

הערה: דוגמאות לתקופת דגירה ומינון נגיפי עבור נגיפים שונים מפורטות באיור 1A. ריכוזים גבוהים יותר של הנגיף יכולים להיבדק גם על ידי הגדלת MOI/PFU.

1. זרעו תאי Huh-7.5 בצלחת של 96 בארות (1 × 10,⁴ תאים לבאר) ודגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור O/N של 5% CO₂ כדי לקבל חד-שכבתי.
2. לדגור על תרכובות הבדיקה או הבקרות (הריכוזים הסופיים הם: CHLA = 50 מיקרומטר; PUG = 50 מיקרומטר; הפרין = 1,000 מיקרוגרם/מ"ל; DMSO = 1%) עם חלקיקי HCV ב-37°C (איור 1A, 'טווח ארוך') ביחס של 1:1. לדוגמה, לחיסון וירוס 100 μl המכיל 1 x 104 FFU, הוסף 100 μl של דילול עבודה CHLA של 100 מיקרומטר; זה מניב טיפול CHLA בריכוז סופי של 50 מיקרומטר.
3. יש לדלל את תערובת הנגיף-תרופה לריכוז "תת-טיפולי" (לא יעיל) של תרכובות הבדיקה. לדוגמה, הריכוז הלא יעיל של CHLA ו- PUG נגד HCV הוא 1 μM31; לכן, זה דורש דילול פי 50 של תערובת וירוס-תרופה אשר ניתן להשיג עם 9.8 מ"ל של מדיום בסיסי (מדיום גידול תאים עם 2% FBS).
   הערה: הדילול לריכוז תת-טיפולי מונע אינטראקציה משמעותית בין תרכובות הבדיקה לבין פני התא המארח ומאפשר לבחון את השפעת הטיפול על הנגיפים נטולי התא. יש לציין כי דילול זה תלוי בתגובת המינון האנטי-ויראלי של תרכובות הבדיקה כנגד הזיהום הנגיפי המסוים ונקבע לפני ביצוע בדיקה ספציפית זו.
4. לשם השוואה, ערבבו את הנגיף עם תרכובות הבדיקה ודללו מיד (ללא תקופת דגירה) לריכוז תת-טיפולי לפני ההדבקה (איור 1A, "טווח קצר").
5. הוסף 100 μl של תערובת תרופות HCV מדוללת על חד-שכבה של תאי Huh-7.5 (כמות הנגיף כעת היא 1 x 10² FFU; MOI סופי = 0.01) ודגור במשך 3 שעות ב 37 ° C כדי לאפשר ספיחה ויראלית.
6. לאחר הזיהום, להסיר את החיסון מדולל בעדינות לשטוף את הבארות עם 200 μl של PBS פעמיים.
   הערה: בצעו את השטיפות בעדינות כדי למנוע הרמת תאים.
7. החל 100 μl של מדיום בסיסי על כל באר לדגור ב 37 ° C במשך 72 שעות.
8. לנתח את הזיהום שנוצר על ידי assay supernatant עבור פעילות luciferase.

איור 1. השבתה של זיהומים ויראליים על ידי תרכובות הבדיקה CHLA ו- PUG. וירוסים שונים טופלו בתרכובות הבדיקה במשך תקופה ארוכה (מודגרות במשך 1.5 – 3 שעות לפני הטיטרציה; עמודות אפורות בהירות) או תקופה קצרה (מדוללות מיד; עמודות אפורות כהות) ב 37 מעלות צלזיוס לפני דילול לריכוז תת-טיפולי וניתוח לאחר מכן של זיהום על התאים המארחים בהתאמה. (A) סכמות של הניסוי (מוצג משמאל) עם ריכוז הנגיף הסופי (PFU/well או MOI), תקופת הדגירה ארוכת טווח של וירוס-תרופה (i) וזמן הדגירה הבא (ii) המסומנים עבור כל וירוס בטבלה מימין. ניתוחים עבור (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV ו- (F) RSV מצוינים בכל לוח נוסף. התוצאות משורטטות כנגד טיפול הבקרה השלילית של DMSO עבור זיהום בנגיף והנתונים המוצגים הם האמצעים ± שגיאות תקן של הממוצע (SEM) משלושה ניסויים עצמאיים. נתון זה שונה מההפניה.