הערכת היעילות של תרכובת בדיקה אנטי-ויראלית באמצעות בדיקת אינאקטיבציה ויראלית

תקציר

מקור: Tai, C. et al., Early Viral Entry Assays for the זיהוי והערכה של תרכובות אנטי-ויראליות. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים את בדיקת ההשבתה הנגיפית, ומציג את הערכת ההשפעה של חומרים אנטי-ויראליים על חלקיקים נגיפיים.

פרוטוקול

1. בדיקת השבתה ויראלית

הערה: דוגמאות לתקופת דגירה ומינון נגיפי עבור נגיפים שונים מפורטות באיור 1A. ריכוזים גבוהים יותר של הנגיף יכולים להיבדק גם על ידי הגדלת MOI/PFU.

1. זרעו תאי Huh-7.5 בצלחת של 96 בארות (1 × 10,⁴ תאים לבאר) ודגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור O/N של 5% CO₂ כדי לקבל חד-שכבתי.
2. לדגור על תרכובות הבדיקה או הבקרות (הריכוזים הסופיים הם: CHLA = 50 מיקרומטר; PUG = 50 מיקרומטר; הפרין = 1,000 מיקרוגרם/מ"ל; DMSO = 1%) עם חלקיקי HCV ב-37°C (איור 1A, 'טווח ארוך') ביחס של 1:1. לדוגמה, לחיסון וירוס 100 μl המכיל 1 x 104 FFU, הוסף 100 μl של דילול עבודה CHLA של 100 מיקרומטר; זה מניב טיפול CHLA בריכוז סופי של 50 מיקרומטר.
3. יש לדלל את תערובת הנגיף-תרופה לריכוז "תת-טיפולי" (לא יעיל) של תרכובות הבדיקה. לדוגמה, הריכוז הלא יעיל של CHLA ו- PUG נגד HCV הוא 1 μM31; לכן, זה דורש דילול פי 50 של תערובת וירוס-תרופה אשר ניתן להשיג עם 9.8 מ"ל של מדיום בסיסי (מדיום גידול תאים עם 2% FBS).
   הערה: הדילול לריכוז תת-טיפולי מונע אינטראקציה משמעותית בין תרכובות הבדיקה לבין פני התא המארח ומאפשר לבחון את השפעת הטיפול על הנגיפים נטולי התא. יש לציין כי דילול זה תלוי בתגובת המינון האנטי-ויראלי של תרכובות הבדיקה כנגד הזיהום הנגיפי המסוים ונקבע לפני ביצוע בדיקה ספציפית זו.
4. לשם השוואה, ערבבו את הנגיף עם תרכובות הבדיקה ודללו מיד (ללא תקופת דגירה) לריכוז תת-טיפולי לפני ההדבקה (איור 1A, "טווח קצר").
5. הוסף 100 μl של תערובת תרופות HCV מדוללת על חד-שכבה של תאי Huh-7.5 (כמות הנגיף כעת היא 1 x 10² FFU; MOI סופי = 0.01) ודגור במשך 3 שעות ב 37 ° C כדי לאפשר ספיחה ויראלית.
6. לאחר הזיהום, להסיר את החיסון מדולל בעדינות לשטוף את הבארות עם 200 μl של PBS פעמיים.
   הערה: בצעו את השטיפות בעדינות כדי למנוע הרמת תאים.
7. החל 100 μl של מדיום בסיסי על כל באר לדגור ב 37 ° C במשך 72 שעות.
8. לנתח את הזיהום שנוצר על ידי assay supernatant עבור פעילות luciferase.

תוצאות

איור 1. השבתה של זיהומים ויראליים על ידי תרכובות הבדיקה CHLA ו- PUG. וירוסים שונים טופלו בתרכובות הבדיקה במשך תקופה ארוכה (מודגרות במשך 1.5 – 3 שעות לפני הטיטרציה; עמודות אפורות בהירות) או תקופה קצרה (מדוללות מיד; עמודות אפורות כהות) ב 37 מעלות צלזיוס לפני דילול לריכוז תת-טיפולי וניתוח לאחר מכן של זיהום על התאים המארחים בהתאמה. (A) סכמות של הניסוי (מוצג משמאל) עם ריכוז הנגיף הסופי (P...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM	גיבקו	11995-040
פ.ב.ס.	גיבקו	26140-079
פניצילין-סטרפטומיצין	גיבקו	15070-063
אמפוטריצין ב	גיבקו	15290-018
DMSO	סיגמא	D5879
ערכת בדיקת טוקסיקולוגיה חוץ גופית, מבוססת XTT	סיגמא	TOX2
PBS pH 7.4	גיבקו	10010023
קורא Microplate	תרמו סיינטיפיק	89087-320
מיקרוצנטריפוגה	תרמו סיינטיפיק	75002420
ערכת בדיקה BioLux Gaussia luciferase	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	E3300L
לומינומטר	פרומגה	גלומקס-20/20
נתרן ציטראט, דיהידראט	סיגמא	71402
אשלגן כלורי	סיגמא	P5405