הערה: ודא שכל ההליכים הכוללים תרבית תאים והדבקה בנגיף מתבצעים במכסי בטיחות ביולוגית מאושרים המתאימים לרמת הבטיחות הביולוגית של הדגימות המטופלות. לצורך תיאור הפרוטוקולים, Gaussia luciferase כתב מתויג HCV משמש וירוס מודל. בהקשר של התוצאות המייצגות, התרכובות חומצה צ'בולאגית (CHLA) ופוניקלאגין (PUG) משמשות כאנטי-ויראליות מועמדות המכוונות לאינטראקציות גליקופרוטאין נגיפי עם גליקוזאמינוגליקנים על פני התא במהלך שלבי הכניסה המוקדמים של הנגיף. הפרין, הידוע כמפריע לכניסתם של וירוסים רבים, משמש כטיפול בקרה חיובי בהקשר כזה.
1. תרבית תאים, הכנת תרכובת וציטוטוקסיות של תרכובות
- הגדל את קו התאים המתאים עבור מערכת ההדבקה בנגיף לניתוח (טבלה 1). עבור HCV, לגדל את תאי Huh-7.5 בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 200 U/ml פניצילין G, 200 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 0.5 מיקרוגרם / מ"ל אמפוטריצין B.
- הכינו את תרכובות הבדיקה והבקרות באמצעות הממסים המתאימים שלהן: לדוגמה, המסו CHLA ו-PUG בדימתיל סולפוקסיד (DMSO); הכינו הפרין במים סטריליים בזיקוק כפול. עבור כל הדילולים הבאים, השתמש ב- culture media.
הערה: הריכוז הסופי של DMSO בטיפולי תרכובת הבדיקה הוא פחות מ -1% בניסויים; 1% DMSO נכלל כטיפול בקרה שלילי בבדיקות לשם השוואה.
- לקבוע את ציטוטוקסיות של תרכובות הבדיקה (למשל, CHLA ו- PUG) על התאים עבור זיהום ויראלי באמצעות מגיב קביעת כדאיות התא כגון XTT (2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-5-phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide):
- עבור HCV, זרעו תאי Huh-7.5 בצלחת של 96 בארות (1 × 104 תאים לכל באר) ודגרו ב -37 מעלות צלזיוס באינקובטור O/N של 5% CO2 כדי לקבל חד-שכבתי.
- החל בקרת DMSO (1%) או הגדלת הריכוזים של תרכובות הבדיקה CHLA ו- PUG (לדוגמה 0, 10, 50, 100 ו- 500 מיקרומטר) על בארות התרבית במשולש.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 72 שעות, ולאחר מכן להשליך את המדיום שבצלחת ולשטוף את התאים עם 200 μl של מלח חוצץ פוספט (PBS) פעמיים.
- הוסף 100 μl של תמיסת בדיקה מתוך ערכת בדיקת טוקסיקולוגיה חוץ גופית מבוססת XTT לכל באר ודגר על הצלחות ב 37 ° C במשך 3 שעות נוספות כדי לאפשר ייצור פורמזן XTT.
- קבע את הבליעה באמצעות קורא microplate באורך גל בדיקה של 492 ננומטר ובאורך גל ייחוס של 690 ננומטר.
- חשב את אחוז התאים ששרדו באמצעות הנוסחה הבאה: כדאיות התא (%) = At / As × 100%, כאשר 'At' ו- 'As' מתייחסים לספיגה של תרכובות הבדיקה ולטיפולי בקרת הממס (לדוגמה 1% DMSO), בהתאמה. קבע את הריכוז של 50% ציטוטוקסיות תאית (CC50) של תרכובות הבדיקה מתוכנה אנליטית כגון GraphPad Prism בהתאם לפרוטוקול היצרן.
2. קריאה של זיהום ויראלי
הערה: הקריאה של זיהום ויראלי תלויה במערכת הווירוסים שבה נעשה שימוש ויכולה לכלול שיטות כגון בדיקות פלאק או מדידת אותות כתב מווירוסים המתויגים על ידי כתב. השיטה לאיתור זיהום מדווח-HCV המבוססת על פעילות המדווח luciferase מתוארת להלן.
- אספו את הסופרנאטנטים מהבארות הנגועות והבהירו ב 17,000 x גרם במיקרוצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- יש לערבב 20 μl של supernatant בדיקה עם 50 μl של מצע luciferase מערכת הבדיקה Gaussia luciferase ולמדוד ישירות עם luminometer בהתאם להוראות היצרן.
- לבטא הדבקה HCV כיומן10 של יחידות אור יחסיות (RLU) לקביעת עיכוב נגיפי (%) ולחשב את הריכוז האפקטיבי של 50% (EC50) של תרכובות הבדיקה נגד זיהום HCV באמצעות אלגוריתמים מתוכנת GraphPad Prism בהתאם לפרוטוקול היצרן.
3. ערך ויראלי/בדיקת פיוז'ן
הערה: דוגמאות לתקופות דגירה ומנות נגיפיות עבור נגיפים שונים מפורטות באיור 1A 'כניסה/היתוך'. ריכוזים גבוהים יותר של הנגיף יכולים להיבדק גם על ידי הגדלת MOI/PFU.
- זרעו תאי Huh-7.5 בצלחת של 96 בארות (1 × 104 תאים לכל באר), ודגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור O/N של 5% CO2 כדי לקבל חד-שכבתי.
- מצננים מראש את חד-שכבות התא בצלחות ב-4°C למשך שעה.
- להדביק את התאים עם HCV (ריבוי של זיהום, MOI = 0.01) ב 4 °C במשך 3 שעות. לדוגמה, השתמש בחיסון וירוס 100 μl המכיל 1 x 102 יחידות יוצרות מיקוד (FFU).
הערה: בצע את התוספת של החיסון הנגיפי על קרח ואת הדגירה שבאה בעקבותיו במקרר 4 מעלות צלזיוס כדי לשמור על הטמפרטורה ב -4 מעלות צלזיוס, המאפשרת קשירה נגיפית אך לא כניסה.
- הסר את supernatant ולשטוף בעדינות את monolayers התא עם 200 μl של PBS קר כקרח פעמיים.
הערה: בצעו את השטיפות בעדינות כדי למנוע הרמת תאים.
- טפל בבארות עם תרכובות הבדיקה או בקרות (הריכוזים הסופיים הם: CHLA = 50 מיקרומטר; PUG = 50 מיקרומטר; הפרין = 1,000 מיקרוגרם/מ"ל; DMSO = 1%) ולדגור ב 37 ° C במשך 3 שעות. לדוגמה, להוסיף 10 μl של 500 מיקרומטר CHLA עובד דילול 90 μl של מדיה, לערבב, ולטפל בארות; זה מניב טיפול CHLA בריכוז סופי של 50 μM.
הערה: המעבר מ-4°C ל-37°C מקל כעת על אירוע הכניסה/היתוך הנגיפי ולכן מאפשר להעריך את השפעת תרכובות הבדיקה על שלב מסוים זה.
- שאפו את הסופרנאטנט המכיל תרופה והסירו וירוסים חוץ-תאיים שאינם מופנמים על ידי שטיפה עם 200 מיקרוליטר של מאגר ציטראט (50 מ"מ נתרן ציטראט, 4 מ"מ אשלגן כלורי, pH 3.0) או PBS. יש למרוח 100 μl של המדיום הבסיסי לפני הדגירה ב-37°C למשך 72 שעות.
- לנתח את הזיהום שנוצר על ידי הערכת supernatant עבור פעילות luciferase כמתואר '2. קריאה של זיהום ויראלי'.
