זיהוי קולורימטרי של סמן ביולוגי חיידקי באמצעות בדיקת לקמוס שונה

תקציר

מקור: Tram, K., et al. זיהוי Colorimetric של חיידקים באמצעות מבחן Litmus. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים שיטת זיהוי קולורימטרית של E. coli, הכוללת סמן ביולוגי של E. coli המפעיל DNAzyme, מה שמוביל לפיצול של קישור RNA וניתוק של צימוד DNAzyme-urase. בדיקה קולורימטרית עוקבת מזהה את הסמן הביולוגי E. coli באמצעות שינויי pH הנגרמים על ידי אמוניה.

פרוטוקול

1. הכנת תאי E. coli לבדיקה

1. לתרחיף תאים רצוי, העבירו 1 מ"ל של ציר בתרבית לצינור מיקרופוגה של 1.5 מ"ל.
2. צנטריפוגה את התאים ב 6,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. בזהירות להסיר את supernatant מבלי להפריע את גלולת התא.
3. הוסף 10 μl של מאגר תגובה לגלולת התא והשהה מחדש את התאים. הפעילו את מתלי התא למשך 5 דקות. מעבירים את מתלה התא לקופסת קרח למשך 5 דקות.
4. הפעילו את מתלי התא למשך 5 דקות נוספות.
5. צנטריפוגה את מתלה התא ב 13,000 x גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C. השתמש supernatant לבדיקה (10 μl).

2. מבחן לקמוס

1. בצינור מיקרופוגה של 1.5 מ"ל, שטפו מראש את הצינור על ידי הוספה וערבול של 100 מיקרוליטר של חיץ תגובה (RB) בצינור המיקרופוגה והשלכת החיץ.
2. העבר 15 μl של EC1 מורכב לצינור microfuge שטף.
3. שטפו את החרוזים המגנטיים על ידי הנחת צינור המיקרופוגה על מדף מגנטי. מוציאים את הסופרנאטנט על ידי פיפטנט. הסר את צינור המיקרופוגה מהמדף, הוסף 100 μl של RB, ובזהירות להשעות מחדש את החרוזים המגנטיים.
4. שטוף את ה-MB פעמיים נוספות על-ידי חזרה על שלב 2.3.
5. הניחו את צינור המיקרופוגה בחזרה על המדף המגנטי, הסירו את הסופרנטנט והוסיפו את דגימת E. coli של 10 μl שהוכנה משלב 1.3.
6. ערבבו בזהירות את הדגימה והחרוזים המגנטיים על ידי הקשה עדינה על צינור המיקרופוגה.
7. לדגור על התגובה בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה.
8. לתגובה, הוסף 90 μl של ddH₂O והנח את צינור המיקרופוגה על מדף מגנטי.
9. לאחר כ-3 דקות של הפרדה מגנטית, העבירו בזהירות 85 μl של הסופרנאטנט לצינור מיקרופוגה של 0.5 מ"ל. משכו את הסופרנאטנט באיטיות כדי להימנע מאיסוף חרוזים מגנטיים.
10. לצינור המיקרופוגה הנ"ל הוסף 15 μl של 0.04% פנול אדום ו 100 μl של תמיסת המצע.
11. צלם תמונה במרווחי זמן ספציפיים כדי לתעד שינוי צבע.
    הערה: ניתן לנטר את השינוי ב- pH גם באמצעות מד pH עם מיקרואלקטרודה. ה- pH ההתחלתי צריך להיות כ 5.2-5.5 (הפתרון הוא צהוב). אם לא, הפתרון יכול להיות מותאם על ידי תוספת של 1 mM אצטט חיץ pH 5.0).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA)	VWR אמרסקו	105
כדורי נתרן הידרוקסידי (NaOH)	BIO BASIC CANADA INC	SB6789
בסיס טריס	VWR אמרסקו	497
אוריאה	VWR אמרסקו	M123
Xylenecyanol FF	סיגמה-אולדריץ'	X-4126
0.04% פנול אדום	סיגמה-אולדריץ'	P3532
10x T4 פולינוקלאוטיד קינאז חיץ תגובה	לוציגן	30061-1
אי קולי K12 (MG1655)	ATCC	ATCC700926
חרוז מגנטי (BioMag)	באנגס מעבדות Inc
מתלה הפרדה מגנטית	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	S1506S
צינורות מיקרופוגה	זארשטדט	72.69
אינקובטור תרביות תאים	אפנדורף סיינטיפיק	M13520000
ברנסון שואב אולטראסוני	ברנסון	לא ישים