בדיקת כתב לוציפראז לחקר ויסות תרגום בתאים נגועים באבעבועות רוח

תקציר

מקור: Dhungel, P., et al. In Vitro Trancribed RNA based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Implanted Cells infected Virus. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים בדיקה לחקר ויסות התרגום בתאים נגועים באבעבועות רוח. תאים לא נגועים ונגועים בנגיף הודבקו יחד עם mRNA המקודד עבור לוציפראז גחלילית (Fluc) ו Renilla luciferase (Rluc), כאשר mRNA Fluc מכיל רצף מוביל 5' Poly(A). עם הוספת מצעים ביולומינסנטיים על תאים lysed, למדוד את האות משני luciferases כדי לזהות את היתרון התרגומי של mRNA Fluc בתאים נגועים בנגיף, המוענק על ידי רצף מוביל.

פרוטוקול

1. העברת mRNA לתאים

1. זרעו תאי HeLa בצלחת של 24 בארות (שיהיו בערך ~ 80-90% במפגש למחרת) ודגרו לילה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
2. להדביק תאי HeLa בנגיף החיסון (VACV) בריבוי זיהומים (MOI) של 5 או לשמור תאי HeLa לא נגועים לצורך השוואה.
   הערה: MOI הוא מספר החלקיקים הנגיפיים הזיהומיים בכל תא.
3. MOI של X = {[(מספר תאים * X) / טיטר וירוס] * 1000} μl של וירוס לכל 1 מ"ל בינוני.
4. לאחר h הרצוי לאחר ההדבקה (hpi) (בניסוי זה ב 10-12 hpi), transfect mRNA (500 ng של mRNA הכולל לכל באר של לוחות 24 באר) באמצעות מגיב טרנספקציה קטיוני שומנים כפי שמוצג באיור 1C.
   1. עבור באר אחת של צלחת 24 בארות, ערבבו 480 ng של רצף 12A הנושא mRNA של גחלילית (12A-Fluc) ו-20 ng של רצף Kozak הנושא את Renilla luciferase (Kozak-Rluc) mRNA בצינור מיקרוצנטריפוגה אחד. בצינור מיקרוצנטריפוגה אחר להוסיף 1.1 μL של מגיב transfection שומנים קטיוניים.
   2. הוסף 55 μL של מדיום סרום מופחת בשני הצינורות. מערבבים ודגרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
   3. לאחר 5 דקות של דגירה, להוסיף 55 μL מגיב טרנספקציה שומנים קטיוני המכיל מדיום סרום מופחת בצינור mRNA המכיל mRNA.
   4. מערבבים בעדינות אך ביסודיות, ודוגרים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
   5. במהלך הדגירה, להסיר את המדיום תרבית התא ולהוסיף 400 μL של מדיום סרום מופחת לכל באר של 24 צלחות באר.
   6. לאחר הדגירה, מוסיפים 100 μL של התערובת טיפה באופן שווה לבאר אחת של צלחות 24 באר.

2. מדידת פעילויות לוציפראז

1. חמש שעות לאחר הטרנספקציה המשותפת של 12A-Fluc ו-Kozak-Rluc mRNA, מודדים את פעילות הלוציפראז באמצעות מערכת בדיקת לוציפראז המסוגלת לבצע שתי בדיקות כתב (למשל, ערכת בדיקת Dual-Luciferase Reporter).
2. הסר את מדיום הסרום המופחת וליזה את התאים על ידי הוספת 150 μL 1x lysis buffer, מרכיב של ערכת בדיקת luciferase.
3. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, אוספים את הליזט על ידי גירוד התאים ומעבירים אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה.
4. צנטריפוגה את הליזט ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי פסולת תא כדור.
5. הוסף 30 μL של supernatant בלוח בדיקה לבן אטום 96 בארות עם תחתית מוצקה.
6. מדוד את עוצמת האור הכפולה באמצעות ערכת בדיקת לוציפראז ומד תאורה של קורא לוחות רב-מצבים.
7. בצע את המדידה באמצעות פונקציית הקינטיקה (על בסיס באר) באמצעות ההגדרות המתוארות בטבלה 1.
   הערה: ניתן לבצע את הקריאה גם באמצעות לומינומטר ידני. מוסיפים נפח שווה של ליזט ומצע לפלוק בקובט. המתן 2 שניות ומדוד במשך 10 שניות באמצעות לומינומטר. לאחר מדידת Fluc, הוציאו במהירות את הקובט מהלמנומטר והוסיפו נפח שווה של המצע עבור Rluc באופן ידני. שוב, המתן 2 שניות ומדדו במשך 10 שניות באמצעות לומינומטר.
8. יצא את נתוני קריאת הזוהר לתבנית קובץ רצויה.
9. קבע את שיעור התרגום היחסי מ- mRNA 12A-Fluc בתאי HeLa לא נגועים ונגועים ב- VACV על ידי חלוקת ערך Fluc בערך Rluc הבקרה הפנימית.
   הערה: איור 2 מציג ניתוח שלב אחר שלב של נתונים גולמיים כדי לקבל פעילות Fluc יחסית.

טבלה 1: הגדרות מדידה של לוציפראז – השלבים למדידת לוציפראז עם הנפח או הזמן המומלצים.

שלבים	עוצמת קול/זמן
להזריק מצע Assay Luciferase (Fluc):	30 מיקרוליטר
זמן המתנה/דגירה:	2 שניות
מדידת לומינסנציה (Fluc):	10 שניות
מצע Stop & Glo (Rluc):	30 מיקרוליטר
זמן המתנה/דגירה:	2 שניות
מדידת לומינסנציה (Rluc):	10 שניות

תוצאות

איור 1: סינתזת mRNA וטרנספקציה. (A) סכמטי של תעתיק חוץ גופי. DNA מוגבר על ידי PCR המכיל את הגן luciferase במורד הזרם מ 5'-UTR של עניין ואת מקדם T7 משמש כתבנית. T7 RNA פולימראז מגויס למקדם ומוסיף ריבונוקלאוטידים, המוצגים בלבן, מכיוון 5' עד 3'. ברגע שאורך mRNA הוא 25-30 nt, מוסיפים מכסה m7G באמצעות אנלוגי נגד כובע הפוך, ARCA. (B) רצועות RNA משעתוק חוץ גופי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קורנינג 96 באר חצי שטח לבן שטוח תחתון פוליסטירן microplate	קורנינג	3693	צלחת לבנה אטומה 96 היטב עם תחתית מוצקה
מערכת בדיקת כתב לוציפראז כפול	פרומגה	E1960	ערכת בדיקת לוציפראז כפול (DLAK)
GloMax Navigator Microplate Luminometer	פרומגה	GM2010	מכונה luminometer קורא לוחות multimode
ליפופקטמין 2000	תרמו פישר סיינטיפיק	11668019	מגיב טרנספקציה שומנים קטיוניים
Opti-MEM	תרמו פישר סיינטיפיק	31985070	מדיה מופחתת בסרום