שיטת צלחת מיקרוטיטר להערכת הריכוז המעכב המינימלי של אנטיביוטיקה

תקציר

מקור: Ketelboeter, L. M., et al. שיטות לעכב ייצור פיומלנין חיידקי ולקבוע את העלייה המתאימה ברגישות לעקה חמצונית. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים שיטה מבוססת צלחת מיקרוטיטר לקביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של אנטיביוטיקה לבדיקה נגד חיידקים. עם הוספת תרחיף של הפתוגן החיידקי Pseudomonas aeruginosa לצלחת מיקרוטיטר המכילה דילולים סדרתיים של אנטיביוטיקה לבדיקה, ומעכב ייצור פיומלנין על ידי החיידקים, נמדדת הצפיפות האופטית של הבארות כדי לחשב את הריכוז המעכב המינימלי של האנטיביוטיקה, ואת ההשפעה של מעכב ייצור פיומלנין על הרגישות לאנטיביוטיקה של החיידקים.

פרוטוקול

1. בדיקת ריכוז מעכב מינימלי אנטיביוטי (MIC) בצלחות 96 בארות

1. הגדר תרביות לילה של הזנים שייבדקו ב- LB (Luria-Bertani) עם וללא NTBC (2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione).
   הערה: פרוטוקול זה מתואר באמצעות הרמה הייצוגית של 300 מיקרומטר NTBC.
   1. הוסף NTBC של 300 מיקרומטר ל- 2 מ"ל ליברות. הוסף נפח שווה ערך של רכב (דימתיל סולפוקסיד, DMSO) ל- 2 מ"ל ליברות עבור תנאי ללא NTBC.
   2. באמצעות קיסמים סטריליים, לחסן צינורות עם מושבה אחת מבודדת של חיידקים. תהיה תרבות אחת עם NTBC ותרבות אחת ללא NTBC לכל זן. יש לדגור לילה בטמפרטורה של 37°C עם אוורור באמצעות מסובב תרבית רקמה באינקובטור אוויר.
2. למחרת, הפוך פתרונות אב LB + NTBC ו- LB + DMSO להגדרת מבחן MIC. הוסף NTBC בריכוז של 600 מיקרומטר מכיוון שזה ידולל פי שניים בעת הוספת החיסון, ויניב ריכוז סופי של 300 מיקרומטר.
   1. כדי לבדוק אנטיביוטיקה אחת עבור זן אחד, הוסף 600 מיקרומטר NTBC ל- 2 מ"ל LB וערבב לקבלת פתרון האב של NTBC. הוסף נפח שווה ערך של רכב (DMSO) ל- 2 מ"ל ליברות וערבב לקבלת פתרון אב ללא NTBC. השתמש בפתרונות אלה ליצירת פתרונות מלאי אנטיביוטיים וכן להגדרת סדרת הדילול בצלחות 96 בארות.
      הערה: ניסוחי פתרון האב יניבו פתרונות נוספים להתחשבות בטעויות צנרת. ניתן להגדיל או להקטין את תמיסות האב בהתאם לצורך, בהתאם למספר האנטיביוטיקות והזנים שנבדקו.
3. הכן את התמיסות האנטיביוטיות בפתרונות האב LB + NTBC או LB + DMSO.
   הערה: ריכוז האנטיביוטיקה בתמיסות אלה צריך להיות כפול מהריכוז הסופי הרצוי. יש לעשות פתרון מספיק כדי להעביר 100 μl לארבע בארות בצלחת 96 בארות.
   1. הכינו תמיסת מלאי גנטמיצין +/- NTBC במינון 64 מיקרוגרם/מ"ל. כדי ליצור פתרון זה, הוסף 0.288 μl של מלאי gentamicin (100 מ"ג / מ"ל) ל 450 μl LB + NTBC או LB + DMSO פתרון אב.
      הערה: הריכוז המרבי של גנטמיצין עבור Pseudomonas aeruginosa PAO1 הוא 32 מיקרוגרם/מ"ל.
   2. הפוך את תמיסת המניות kanamycin +/- NTBC ב 256 מיקרוגרם / מ"ל. כדי ליצור פתרון זה, הוסף 3.84 μl של מלאי kanamycin (30 מ"ג / מ"ל) ל 450 μl LB + NTBC או LB + DMSO master solutions.
      הערה: הריכוז המרבי של קנמיצין עבור P. aeruginosa PAO1 הוא 128 מיקרוגרם/מ"ל.
   3. הכינו תמיסת מלאי טוברמיצין +/- NTBC במינון של 8 מיקרוגרם/מ"ל. כדי ליצור פתרון זה, הוסף 0.36 μl של מלאי tobramycin (10 מ"ג / מ"ל) ל 450 μl LB + NTBC או LB + DMSO master solutions.
      הערה: עבור P. aeruginosa PAO1, הריכוז המרבי של tobramycin הוא 4 מיקרוגרם / ml.
      הערה: ניתן להתאים את האנטיביוטיקה והריכוזים לבדיקת החיידקים.
4. הוסף 100 μl של כל תמיסת אנטיביוטיקה 2x לארבע בארות בצלחת של 96 בארות. מקם פתרונות אלה בשורה A. לדוגמה, גנטמיצין צריך להיות ממוקם ב- A1 עד A4, קנמיצין צריך להיות ממוקם ב- A5 עד A8, וטוברמיצין צריך להיות ממוקם ב- A9 עד A12. ראו איור 1A לקבלת דיאגרמה של מערך לוחות של 96 בארות.
   הערה: ניתן לבדוק מספר סוגי אנטיביוטיקה בצלחת אחת, אך יש לבדוק רק זן אחד בכל צלחת כדי למנוע את הפוטנציאל לזיהום צולב מזנים אחרים.
5. הוסף 50 μl של פתרון האב LB + NTBC או LB + DMSO לשורות B עד H של לוח 96 הקידוחים. ודא כי צלחת אחת היא LB + NTBC וצלחת אחת היא LB + DMSO. ראו איור 1A.
   1. השתמש LB + NTBC עבור אנטיביוטיקה LB + NTBC. השתמש LB + DMSO עבור אנטיביוטיקה LB + DMSO.
6. באמצעות מיקרו פיפטור לבצע דילול סדרתי כפול של אנטיביוטיקה על ידי העברת 50 μl של התמיסה משורה A לשורה B. מערבבים את התמיסה, לשנות את קצות הפיפט, ולהעביר 50 μl של התמיסה משורה B לשורה C. חזור על הפעולה עבור השורות הנותרות. לאחר דילול שורה G, הסר 50 μl של התמיסה משורה זו והשליך. השתמש בשורה H כבקרה ללא אנטיביוטיקה לצמיחת חיידקים. ראה איור 1B.
   הערה: כל באר בשורות A עד G מכילה כעת 50 μl של אנטיביוטיקה ב- LB + NTBC או LB + DMSO בריכוז הרצוי פי 2. שורה H מכילה LB + NTBC או LB + DMSO ללא אנטיביוטיקה.
7. מדוד את OD₆₀₀ של תרבויות הלילה. לשטוף את כל התרביות לפני נטילת קריאות OD₆₀₀ כדי לחסל pyomelanin נוכח בתקשורת.
   1. לשטוף את התרביות על ידי צנטריפוגה 1 מ"ל של תרבית במיקרוצנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 2 דקות. להסיר את supernatant עם מיקרו pipettor ו resuspend את גלולת התא ב 1 מ"ל LB.
8. לדלל את תרביות הלילה ל 2.75x10⁵ CFU/ml ב- LB.
   הערה: נניח כי יחידת OD₆₀₀ אחת שוות ערך ל- 1x10⁹ CFU/ml עבור P. aeruginosa. המרות OD ל-CFU/ml עשויות להיות שונות בחיידקים אחרים.
9. הוסף 50 μl של תרבית חיידקים מדוללת לבאר המתאימה.
   הערה: יש להוסיף תרביות הגדלות ב- NTBC לבארות המכילות NTBC ויש להוסיף תרבויות הגדלות ב- DMSO לבארות המכילות DMSO. ראו איור 1B.
   1. הוסיפו חיידקים לשלוש בארות לכל זן וריכוז אנטיביוטיקה. הוסף 50 μl של LB לבאר הרביעית כדי לשמש כבקרה על זיהום חיידקי. ראו איור 1B.
   2. השתמש במיקרו פיפטור רב ערוצי כדי לחסן את הבארות. ודא כי קצות pipet נמצאים קרוב לתחתית הבארות בעת הוספת inoculum כדי למנוע זיהום של בארות שכנות.
      הערה: הוספת תרבית חיידקים לבארות תדלל את ריכוזי האנטיביוטיקה וה-NTBC פי שניים.
10. מכסים את צלחות 96 הבארות בפרפילם ודגרים במשך כ-24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. דוגרים על צלחות 96 בארות באופן סטטי, באינקובטור אוויר.
11. לבחון את הלוחות לצמיחת חיידקים בבארות. המיקרופון הוא הריכוז הנמוך ביותר של אנטיביוטיקה שבו לא נראה גידול חיידקים עבור כל שלושת ההעתקים של כל זן.
    1. בדוק חזותית את הצלחת לצמיחה או קרא באמצעות קורא לוחות המוגדר ל- OD₆₀₀.

תוצאות

איור 1: סכמטי של בדיקת מיקרופון אנטיביוטי 96-well plate setup. (A) 100 μl של 2x אנטיביוטיקה בריכוז ההתחלתי הגבוה ביותר נמצאים בשורה A. שורות B עד H מלאות ב-50 μl של LB + NTBC או LB + DMSO ללא אנטיביוטיקה. (B) דילולים סדרתיים כפולים מבוצעים בשורות A עד G, והתוצאה היא 50 μl של אנטיביוטיקה מדוללת בכל באר בריכוז הרצוי הסופי. שורה H היא באר בקרה לצמיחת חי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	סיגמא-אולדריץ'	SML0269-50 מ"ג	נקרא גם ניטיסינון. מסיס ב-DMSO.
ח2O2	סיגמא-אולדריץ'	216763-100 מ"ל	30 wt. % ב- H2O. התייצב.
גנטמיצין	ביו זהב	G-400-100	מסיס ב-H2O. פילטר סטריליזציה.
קנמיצין	פישר סיינטיפיק	BP906-5	מסיס ב-H2O. פילטר סטריליזציה.
טוברמיצין	סיגמא-אולדריץ'	T4014-100MG	מסיס ב-H2O. פילטר סטריליזציה.