1. ייצור הידרוג'ל פוליאקרילאמיד דו-שכבתי דק (PA) על צלחות מרובות בארות
- ייצור הידרוג'ל פוליאקרילאמיד
הערה: ראו איור 1.
- הכינו תמיסות מימיות המכילות 3 - 10% מתמיסת אקרילאמיד ממלאי 40% (ראה טבלת חומרים) ו- 0.06 - 0.6% מתמיסת ביס-אקרילאמיד 2% (ראה טבלת חומרים) לייצור הידרוג'לים בעלי קשיחות כוונון הנעה בין 0.6 kPa ל- 70 kPa. ראו טבלה 1.
- עבור הידרוג'ל 0.6 kPa, יש לערבב 3% אקרילאמיד עם 0.045% ביס-אקרילאמיד. עבור 3 הידרוג'לים kPa, יש לערבב 5% אקרילאמיד עם 0.074% ביס-אקרילאמיד. עבור 10 הידרוג'לים kPa, יש לערבב 10% אקרילאמיד עם 0.075% ביס-אקרילאמיד. עבור 20 הידרוג'לים kPa, יש לערבב 8% אקרילאמיד עם 0.195% ביס-אקרילאמיד. עבור 70 הידרוג'לים kPa, יש לערבב 10% אקרילאמיד עם 0.45% bis-acrylamide.
הערה: פרטים נוספים על השגת קשיחות ההידרוג'ל הרצויה של PA ניתן למצוא במקום אחר.
- הכינו שתי תמיסות מימיות לכל קשיחות הידרוג'ל רצויה. הכן את פתרון 1 כך שיהיה נטול חרוזים ואת פתרון 2 כך שיכיל מיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים בקוטר 0.03% של 0.1 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים).
- Degas Solutions 1 ו-2 על ידי ואקום למשך 15 דקות לסילוק חמצן הידוע כמעכב פילמור של התמיסות.
- הוסף 0.6% מתמיסת APS של 10 גרם/מ"ל ו-0.43% טטרמתילאתילאנדיאמין (TEMED) לתמיסה 1 כדי לאפשר התחלת פילמור. לפעול מהר.
- הוסף 3.6 μL של תמיסה 1 למרכז כל באר של צלחת 24 בארות.
- כסו מיד את הבארות בכיסויים עגולים לא מטופלים בקוטר 12 מ"מ והניחו לתמיסה 1 לשבת במשך 20 דקות כך שהיא תעבור פילמור מלא.
- טפחו בעדינות על מחט מזרק על משטח כדי ליצור וו קטן בקצהו כדי להקל על הסרת הכיסויים. הרימו את הכיסויים באמצעות מחט המזרק.
- הוסף 0.6% מתמיסת APS של 10 גרם/מ"ל ו-0.43% TEMED לפתרון 2. הפקדה 2.4 μL של התערובת על גבי השכבה הראשונה בכל באר של צלחת 24 באר.
- כסו את פתרון 2 בכיסויי זכוכית עגולים בקוטר 12 מ"מ, לחצו בעדינות כלפי מטה באמצעות זוג מלקחיים כדי להבטיח שעובי השכבה השנייה יהיה מינימלי. תנו לתמיסה 2 להתפלמר למשך 20 דקות.
- הוסף 500 μL של 50 mM HEPES pH 7.5 לכל אחת הבארות ולאחר מכן להסיר את כיסויי זכוכית עם מחט מזרק ומלקחיים.
- עיקור, ציפוי קולגן ושיווי משקל של הידרוג'לים פוליאקרילאמיד
- UV-לחשוף את הידרוג'ל במשך 1 שעה במכסה המנוע של תרבית הרקמה כדי לאפשר עיקור.
- הכינו תערובת של 0.5% משקל/נפח sulfosuccinimidyl 6-(4′-azido-2′-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH, ראו טבלת חומרים) ב-1% DMSO ו-50 mM HEPES pH=7.5.
- הוסף 200 μL של פתרון זה על פני השטח העליונים של הידרוג'לים. משחק מהיר, לחשוף אותם UV (302 ננומטר) במשך 10 דקות כדי להפעיל אותם.
- לשטוף את hydrogels פעמיים עם 1 מ"ל של 50 mM HEPES pH = 7.5. חזור על הפעולה במידת הצורך כדי לוודא שכל הקרוסלינקר העודף מוסר.
- חלבון לצפות את ההידרוג'לים עם 200 μL של 0.25 מ"ג / מ"ל זנב חולדה קולגן I (ראה טבלה של חומרים) ב 50 mM של HEPES. לדגור על ההידרוג'לים, עם תמיסת הקולגן למעלה, למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
הערה: למניעת התייבשות/אידוי, הניחו את הפלטות מרובות הבארות בהכלה משנית והוסיפו רקמות ניקוי מעבדה ספוגות במים בשוליים הפנימיים של ההכלה.
- השתמש אפיפלואורסצנטי או מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה 40X כדי למדוד את עובי ההידרוג'לים. עשו זאת על ידי איתור מיקומי z של החלק התחתון (היכן שמשטח הזכוכית נמצא) והמישורים העליונים של ההידרוג'ל (כאשר עוצמת החרוזים הפלואורסצנטיים היא מקסימלית). לאחר מכן החסרו את מיקומי z כדי לקבוע את הגובה.
הערה: השתמשנו במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך ובמטרה פי 40 עם צמצם מספרי 0.65 כדי למדוד את עובי ההידרוג'לים. מדידות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) יכולות להתבצע גם בנקודה זו כדי לאשר את הנוקשות המדויקת של ההידרוג'לים (ראו איור 2).
- לפני זריעת התאים המעניינים על ההידרוג'לים, הוסף 1 מ"ל של מדיה על ההידרוג'לים ודגר עליהם ב 37 ° C במשך 30 דקות עד 1 שעה כדי להבטיח שיווי משקל.
הערה: הוספנו מדיה מלאה של MCDB-131 מכיוון שזו המדיה שבה תאי המודל המארח (HMEC-1) גודלו בתרבית (ראה שלב 2.1 לקבלת פרטים).
2. תרבית תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים וזריעה על הידרוג'לים
- תרבית תאי HMEC-1 (אנדותל אנושי, מיקרו-וסקולרי) במדיה מלאה MCDB-131 המכילה מדיה MCDB-131 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, 10 ננוגרם/מ"ל של גורם גדילה אפידרמלי, 1 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון ו-2 מ"מ L-גלוטמין (ראו טבלת חומרים).
- לפצל את התרביות 1: 6 כל 3 - 4 ימים ולשמור את התאים עד מעבר 40.
- יום לפני הניסוי, נתקו את התאים מכלי התרבית שלהם באמצעות 0.25% טריפסין/EDTA. ראשית לשטוף את התאים ואת כלי התרבית שלהם 1x עם מלוחים סטריליים פוספט חוצץ (PBS), ולאחר מכן להוסיף את הכמות המתאימה של 0.25% טריפסין/EDTA (2 מ"ל לכל צלחת 100 מ"מ או בקבוק 75 ס"מ, 1 מ"ל לכל צלחת 60 מ"מ או בקבוק 25 ס"מ), לדגור את הבקבוק ב 37 ° C במשך 5 - 10 דקות כדי לאפשר ניתוק של התאים מן המצע שלהם.
- נטרלו את הטריפסין על ידי הוספת הנפח הרצוי של מדיה מלאה MCDB-131, פיזרמו בעדינות כדי לפרק את גושי התאים, ולאחר מכן הכניסו את התמיסה לצינור צנטריפוגה חרוטית.
- מערבלים בעדינות את תמיסת התאים כדי להבטיח שהתאים מפוזרים באופן שווה ואז מוציאים 20 מיקרוליטר של התמיסה וממלאים בעדינות רבה את שני התאים מתחת למכסה של המוציטומטר זכוכית.
- גלולה למטה את הפתרון של תאים הכלולים צינור צנטריפוגה חרוט באמצעות צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 500 x גרם.
- במהלך תקופת ההמתנה של 10 דקות, ספור את התאים באמצעות המוציטומטר. השתמש במיקרוסקופ, התמקד בקווי הרשת של ההמוציטומטר עם מטרה של 10X, ולאחר מכן השתמש במונה ידני כדי לספור את מספר התאים בריבוע אחד של 1 מ"מ x 1 מ"מ.
- העבר את ההמוציטומטר לריבוע אחר בגודל 1 מ"מ x 1 מ"מ, ספור את התאים שם ולאחר מכן חזור על התהליך פעמיים נוספות. חשב את הממוצע של ארבע המדידות ולאחר מכן הכפל את הממוצע ב- 104. הערך הסופי הוא מספר התאים הקיימים/מ"ל בתרחיף התא שעובר צנטריפוגה.
- הסר את הנוזל מצינור הצנטריפוגה החרוטי תוך הבטחה שכדור התא אינו מופרע. השהה מחדש את התאים במדיה המלאה MCDB-131 בריכוז של 4 x 105 תאים/מ"ל.
- זרעו את התאים בתרחיף על ההידרוג'לים על ידי הסרת המדיה שבה הודגרו ההידרוג'לים ולאחר מכן הוספת 1 מ"ל של תרחיף תאים על כל הידרוג'ל.
3. זיהום של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים עם מונוציטוגנים של ל.
- שלושה ימים לפני ההדבקה, יש להוציא את זן ה-Lm לשימוש ממלאי גליצרול (מאוחסן בטמפרטורה של -80°C) על צלחת BHI-agar המכילה 7.5 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול ו-200 מק"ג/מ"ל סטרפטומיצין, במידת הצורך.
הערה: הזן שיש לפסים יכול להיות מסוג פראי או מוטנטי, המבטא פלואורסצנטיות (עבור צביעה חיסונית JAT1045 שימש) או מבטא פלואורסצנטיות תחת מקדם ActA (עבור ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופ כוח משיכה JAT983 או JAT985 שימשו).
- לדגור צלחות ב 37 ° C עד מושבות בדידים נוצרות (1 - 2 ימים).
- יום לפני ההדבקה, לגדל את הזן הרצוי במשך הלילה, לנער אותו ב 150 סל"ד ב 30 ° C במדיה BHI עם 7.5 מיקרוגרם / מ"ל של chloramphenicol (במידת הצורך).
- מניחים 5 מ"ל של מדיה BHI בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל, מוסיפים 7.5 מיקרוגרם / מ"ל של כלוראמפניקול (במידת הצורך), ולאחר מכן מחסנים מושבה אחת מצלחת האגר באמצעות קצה סטרילי של 10 μL.
- למחרת, ממש לפני ההדבקה, מדדו את הצפיפות האופטית של תמיסת החיידקים ב-600 ננומטר (OD600) על ידי דילול הדגימה ביחס של 1:5; השתמשו בקובט המכיל BHI בלבד כדי לשמש כחסר.
- דללו את תרבית הלילה ל-OD600 של 0.1 ודגרו עליה, תוך ניעור במשך שעתיים בטמפרטורה של 30°C, במדיה BHI עם 7.5 מיקרוגרם/מ"ל של כלוראמפניקול (במידת הצורך) כדי לאפשר לחיידקים להגיע לצמיחה בשלב הלוג.
- למדוד את OD600 של הפתרון החיידקי, אשר צפוי להיות סביב 0.2 - 0.3. אם OD600 גבוה יותר, לדלל אותו ל 0.2 - 0.3 עם BHI בלבד.
- קח 1 מ"ל של תמיסה חיידקית לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. סובבו אותו במשך 4 דקות במהירות של 2,000 x גרם באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת החיידקים ב 1 מ"ל של PBS כיתה תרבית רקמה, במכסה המנוע של תרבית הרקמה. שטפו את החיידקים פעמיים נוספות על ידי סיבובם במשך 4 דקות במהירות של 2,000 x גרם בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ו resuspend את החיידקים ב 1 מ"ל של PBS.
- הכן את תערובת הזיהום על ידי ערבוב 10 או 50 μL של חיידקים מרחפים מחדש PBS עם 1 מ"ל של MCDB-131 מדיה מלאה עבור ריבוי של זיהום (MOI; כלומר, מספר החיידקים לתא מארח) של כ-50 חיידקים לתא מארח או 10 חיידקים לתא מארח.
- הסר את התקשורת מהבארות של לוחות 24 בארות, נזהר לא להפריע הידרוג'לים או את התאים. לשטוף את התאים 1x עם 1 מ"ל של MCDB-131 מדיה מלאה ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של חיידקים לכל באר.
- מכסים את הצלחת במכסה שלה ועוטפים את הצלחות בניילון פוליאתילן כדי למנוע דליפה. מניחים את הלוחות בצנטריפוגה ומסובבים את הדגימות במשך 10 דקות ב 200 x גרם כדי לסנכרן את הפלישה. מעבירים את הצלחות לאינקובטור תרבית הרקמה ודגרים עליהן למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
- שטפו את הדגימות 4x עם מדיה מלאה MCDB-131 והעבירו אותן לחממת תרבית הרקמות. לאחר 30 דקות נוספות, החלף את המדיה במדיה בתוספת 20 מיקרוגרם / מ"ל של גנטמיצין.
4. ציטומטריית זרימה לכימות קשיחות מטריצה חוץ-תאית רגישות תלויה של תאים מארחים לזיהום
- שוקלים 5 מ"ג של collagenase ומניחים אותו בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל. מוסיפים 10 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ומערבבים אותם היטב.
- 8 שעות לאחר ההדבקה, להסיר את התקשורת מן הבארות של צלחת 24 בארות ולשטוף את הבארות 1x עם תרבית רקמות PBS. הסר את PBS מהבארות והוסף 200 μL של תערובת טריפסין-EDTA/collagenase לכל באר. הניחו אותו באינקובטור תרביות הרקמה למשך 10 דקות כדי לאפשר ניתוק מלא של התאים.
- השתמשו בפיפט טרי לכל באר ומזלפים את התערובת פי 8. היו עדינים כדי לא לפגוע בתאים. הוסף 200 μL של מדיה מלאה לכל באר כדי לנטרל את הטריפסין.
- העבירו את תמיסת התאים של 400 מיקרוליטר מכל באר לצינור פוליסטירן של 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים של 35 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים).
- נתח 10,000 - 20,000 תאים לדגימה לפי ציטומטריית זרימה. בצע איסוף נתונים באמצעות ציטומטריית זרימה וקבע את אחוז התאים הנגועים לכל באר באמצעות תוכנה רלוונטית הזמינה מסחרית. השתמש בתרשימי הפיזור קדימה לעומת פיזור צדדי כדי לשער את עיקר ההתפלגות של ספירות התא.
הערה:: פעולה זו תבטיח ניתוח של תאים בודדים ותסלק פסולת או הכפלת תאים או שלישיות.
- למדוד את האות הפלואורסצנטי מתאים שאינם נגועים בבקרה ולשער את אוכלוסיית התאים הנגועים למעט אוטופלואורסצנציה.
טבלה 1. הרכב הידרוג'לים פוליאקרילאמיד (PA) בעלי קשיחות משתנה. בטבלה זו, אחוז תמיסת האקרילאמיד 40% ואחוז תמיסת ביס-אקרילאמיד 2% להשגת קשיחות נתונה (מודולוס יאנג, E) מסומנים בעמודות שונות.
| המודולוס של יאנג (E, kPa) | אקרילאמיד % (מ-40% מלאי) | Bisacrylamide % (מ 2% מלאי) |
| 0.6 | 3 | 0.045 |
| 3 | 5 | 0.075 |
| 10 | 10 | 0.075 |
| 20 | 8 | 0.195 |
| 70 | 10 | 0.45 |
