מיקרוסקופ כמותי בהילוך מהיר להערכת הפצת חיידקים חוץ-תאיים תלויי קשיחות

Abstract

מקור: Bastounis, E. E. et al., A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Study the effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells. J. Vis. Exp.(2018)

סרטון זה מציג מיקרוסקופ כמותי בהילוך מהיר להערכת הפצת מונוציטוגנים תלויי קשיחות מטריצה חוץ-תאית באמצעות תאי אנדותל. הידרוג'ל רך יותר מאפשר הפצה מהירה יותר של חיידקים דרך תאי אנדותל בהשוואה לעמיתים נוקשים יותר, ומדגיש את ההשפעה של קשיחות מטריצה על הפצת חיידקים.

Protocol

1. ייצור הידרוג'ל פוליאקרילאמיד דו-שכבתי דק (PA) על צלחות מרובות בארות

1. יש להמיס אמוניום פרסולפט (APS) במים אולטרה-טהורים מזוקקים כדי להגיע לריכוז סופי של 10 גרם/מ"ל. Aliquot ולאחסן את הפתרון ב 4 °C לשימוש לטווח קצר (3 שבועות).
   הערה: ניתן להכין את הפתרון הנ"ל מראש לייצור הידרוג'ל.
2. הפעלת זכוכית של צלחות 24 בארות
   1. לדגור על לוחות זכוכית תחתונים של 24 בארות עם בארות בקוטר 13 מ"מ (ראה טבלת חומרים) למשך שעה אחת עם 500 מיקרוליטר של 2 M נתרן הידרוקסידי (NaOH) לכל באר בטמפרטורת החדר.
   2. שטפו את הבארות 1x עם מים טהורים במיוחד ולאחר מכן להוסיף 500 μL של 2% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (ראה טבלה של חומרים) ב 95% אתנול לכל באר במשך 5 דקות.
   3. שטפו שוב את הבארות פעם אחת במים והוסיפו 500 מיקרוליטר של 0.5% גלוטראלדהיד לכל באר למשך 30 דקות. שטפו את הבארות פעם אחת במים וייבשו אותן ב-60°C כשהמכסה כבוי.
3. ייצור הידרוג'ל פוליאקרילאמיד
   הערה: ראה איור 1.
   1. הכינו תמיסות מימיות המכילות 3 - 10% מתמיסת אקרילאמיד ממלאי 40% (ראה טבלת חומרים) ו- 0.06 - 0.6% מתמיסת ביס-אקרילאמיד 2% (ראה טבלת חומרים) לייצור הידרוג'לים בעלי קשיחות כוונון הנעה בין 0.6 kPa ל- 70 kPa. ראו טבלה 1.
      1. עבור הידרוג'ל 0.6 kPa, יש לערבב 3% אקרילאמיד עם 0.045% ביס-אקרילאמיד. עבור 3 הידרוג'לים kPa, יש לערבב 5% אקרילאמיד עם 0.074% ביס-אקרילאמיד. עבור 10 הידרוג'לים kPa, יש לערבב 10% אקרילאמיד עם 0.075% ביס-אקרילאמיד. עבור 20 הידרוג'לים kPa, יש לערבב 8% אקרילאמיד עם 0.195% ביס-אקרילאמיד. עבור 70 הידרוג'לים kPa, יש לערבב 10% אקרילאמיד עם 0.45% ביס-אקרילאמיד.
         הערה: פרטים נוספים על השגת קשיחות ההידרוג'ל הרצויה של PA ניתן למצוא במקום אחר.
   2. הכינו שתי תמיסות מימיות לכל קשיחות הידרוג'ל רצויה. הכן את פתרון 1 כך שיהיה נטול חרוזים ואת פתרון 2 כך שיכיל מיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים בקוטר 0.03% של 0.1 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים).
   3. Degas Solutions 1 ו-2 על ידי ואקום למשך 15 דקות לסילוק חמצן הידוע כמעכב פילמור של התמיסות.
   4. הוסף 0.6% מתמיסת APS של 10 גרם/מ"ל ו-0.43% טטרמתילאתילאנדיאמין (TEMED) לתמיסה 1 כדי לאפשר התחלת פילמור. לפעול מהר.
   5. הוסף 3.6 μL של תמיסה 1 למרכז כל באר של צלחת 24 באר (ראה שלב 1.2 להכנתו).
   6. כסו מיד את הבארות בכיסויים עגולים לא מטופלים בקוטר 12 מ"מ והניחו לתמיסה 1 לשבת במשך 20 דקות כך שהיא תעבור פילמור מלא.
   7. טפחו בעדינות על מחט מזרק על משטח כדי ליצור וו קטן בקצהו כדי להקל על הסרת הכיסויים. הרימו את הכיסויים באמצעות מחט המזרק.
   8. הוסף 0.6% מתמיסת APS של 10 גרם/מ"ל ו-0.43% TEMED לפתרון 2. הפקדה 2.4 μL של התערובת על גבי השכבה הראשונה בכל באר של צלחת 24 באר.
   9. כסו את פתרון 2 בכיסויי זכוכית עגולים בקוטר 12 מ"מ, לחצו בעדינות כלפי מטה באמצעות זוג מלקחיים כדי להבטיח שעובי השכבה השנייה יהיה מינימלי. תנו לתמיסה 2 להתפלמר למשך 20 דקות.
   10. הוסף 500 μL של 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) pH 7.5 לכל אחת הבארות ולאחר מכן להסיר את כיסויי זכוכית עם מחט מזרק ומלקחיים.
4. עיקור, ציפוי קולגן ושיווי משקל של הידרוג'לים פוליאקרילאמיד
   1. UV-לחשוף את הידרוג'ל במשך 1 שעה במכסה המנוע של תרבית הרקמה כדי לאפשר עיקור.
   2. הכינו תערובת של 0.5% משקל/נפח sulfosuccinimidyl 6-(4′-azido-2′-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH, ראה טבלה של חומרים) ב 1% dimethyl sulfoxide (DMSO) ו 50 mM HEPES pH = 7.5.
   3. הוסף 200 μL של פתרון זה על פני השטח העליונים של הידרוג'לים. משחק מהיר, לחשוף אותם UV (302 ננומטר) במשך 10 דקות כדי להפעיל אותם.
   4. לשטוף את hydrogels פעמיים עם 1 מ"ל של 50 mM HEPES pH = 7.5. חזור על הפעולה במידת הצורך כדי לוודא שכל הקרוסלינקר העודף מוסר.
   5. חלבון לצפות את ההידרוג'לים עם 200 μL של 0.25 מ"ג / מ"ל זנב חולדה קולגן I (ראה טבלה של חומרים) ב 50 mM של HEPES. לדגור על ההידרוג'לים, עם תמיסת הקולגן למעלה, למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: כדי למנוע התייבשות/אידוי, הניחו את הפלטות מרובות הבארות בהכלה משנית והוסיפו רקמות ניקוי מעבדה ספוגות במים בשוליים הפנימיים של ההכלה.
   6. השתמש אפיפלואורסצנטי או מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה 40X כדי למדוד את עובי ההידרוג'לים. עשו זאת על ידי איתור מיקומי z של החלק התחתון (היכן שמשטח הזכוכית נמצא) והמישורים העליונים של ההידרוג'ל (כאשר עוצמת החרוזים הפלואורסצנטיים היא מקסימלית). לאחר מכן החסרו את מיקומי z כדי לקבוע את הגובה.
      הערה: השתמשנו במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך ובמטרה של 40X עם צמצם מספרי 0.65 כדי למדוד את עובי ההידרוג'לים. מדידות של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) יכולות להתבצע גם בשלב זה כדי לאשר את הקשיחות המדויקת של ההידרוג'לים (ראו איור 2).
   7. לפני זריעת התאים המעניינים על ההידרוג'לים, הוסף 1 מ"ל של מדיה על ההידרוג'לים ודגר עליהם ב 37 ° C במשך 30 דקות עד 1 שעה כדי להבטיח שיווי משקל.
      הערה: הוספנו מדיה מלאה של MCDB-131 מכיוון שזו המדיה שבה תאי המודל המארח (HMEC-1) גודלו בתרבית (ראה שלב 2.1 לקבלת פרטים).

2. תרבית תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים וזריעה על הידרוג'לים

1. תרבית תאי HMEC-1 (אנדותל אנושי, מיקרו-וסקולרי) במדיה מלאה MCDB-131 המכילה מדיה MCDB-131 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, 10 ננוגרם/מ"ל של גורם גדילה אפידרמלי, 1 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון ו-2 מ"מ L-גלוטמין (ראו טבלת חומרים).
2. לפצל את התרביות 1:6 כל 3-4 ימים ולשמור את התאים עד מעבר 40.
3. יום לפני הניסוי, נתקו את התאים מכלי התרבית שלהם באמצעות 0.25% טריפסין/EDTA. ראשית, שטפו את התאים ואת כלי התרבית שלהם 1x עם מלח חוצץ פוספט סטרילי (PBS), ולאחר מכן הוסיפו את הכמות המתאימה של 0.25% טריפסין/EDTA (2 מ"ל לצלחת של 100 מ"מ או צלוחיות של 75 ס"מ, 1 מ"ל לצלחת של 60 מ"מ או צלוחיות של 25 ס"מ), תוך הדגירה של הבקבוק בטמפרטורה של 37°C למשך 5 - 10 דקות כדי לאפשר ניתוק של התאים מהמצע שלהם.
4. נטרלו את הטריפסין על ידי הוספת הנפח הרצוי של מדיה מלאה MCDB-131, פיזרמו בעדינות כדי לפרק את גושי התאים, ולאחר מכן הכניסו את התמיסה לצינור צנטריפוגה חרוטית.
5. מערבלים בעדינות את תמיסת התאים כדי להבטיח שהתאים מפוזרים באופן שווה ואז מוציאים 20 מיקרוליטר של התמיסה וממלאים בעדינות רבה את שני התאים מתחת למכסה של המוציטומטר זכוכית.
6. גלולה למטה את הפתרון של תאים הכלולים צינור צנטריפוגה חרוט באמצעות צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 500 x גרם.
7. במהלך תקופת ההמתנה של 10 דקות, ספור את התאים באמצעות המוציטומטר. השתמש במיקרוסקופ, התמקד בקווי הרשת של ההמוציטומטר עם מטרה של 10X, ולאחר מכן השתמש במונה ידני כדי לספור את מספר התאים בריבוע אחד של 1 מ"מ x 1 מ"מ.
8. העבר את ההמוציטומטר לריבוע אחר בגודל 1 מ"מ x 1 מ"מ, ספור את התאים שם ולאחר מכן חזור על התהליך פעמיים נוספות. חשב את הממוצע של ארבע המדידות ולאחר מכן הכפל את הממוצע ב- 10⁴. הערך הסופי הוא מספר התאים הקיימים/מ"ל בתרחיף התא שעובר צנטריפוגה.
9. הסר את הנוזל מצינור הצנטריפוגה החרוטי תוך הבטחה שכדור התא אינו מופרע. השהה מחדש את התאים במדיה המלאה MCDB-131 בריכוז של 4 x 10⁵ תאים/מ"ל.
10. זרעו את התאים בתרחיף על ההידרוג'לים על ידי הסרת המדיה שבה הודגרו ההידרוג'לים ולאחר מכן הוספת 1 מ"ל של תרחיף תאים על כל הידרוג'ל.

3. זיהום של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים עם ליסטריה מונוציטוגנים (Lm)

1. הכנה מוקדמת
   הערה: הכן מראש את הפתרונות הבאים.
   1. מניות סטרפטומיצין, כלורמפניקול וגנטמיצין
      1. הכן 50 מ"ג / מ"ל של תמיסות מלאי סטרפטומיצין על ידי שקילת 0.5 גרם של סטרפטומיצין סולפט והמסתו לחלוטין לתוך 10 מ"ל של מים טהורים במיוחד.
      2. הכינו 7.5 מ"ג/מ"ל של תמיסות ציר כלוראמפניקול על ידי שקילת 75 מ"ג כלוראמפניקול והמסתו לחלוטין ל-10 מ"ל של 100% אתנול.
      3. הכן 20 מ"ג / מ"ל של תמיסות מלאי גנטמיצין על ידי שקילת 0.2 גרם של גנטמיצין סולפט והמסתו לחלוטין לתוך 10 מ"ל של מים טהורים במיוחד.
      4. סנן-עיקור כל פתרונות המלאי עם מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר ואחסן אותם ב -20 ° C לשימוש לטווח ארוך (1 - 2 חודשים).
   2. עירוי לב מוחי (BHI) מדיה וצלחות אגר
      1. אתרו שתי צלוחיות 1-L והוסיפו מוט ערבוב מגנטי בתוך כל בקבוק.
      2. עבור חומרי האחסון של BHI, יש להוסיף 37 גרם אבקת BHI בבקבוק אחד ולהוסיף מים טהורים במיוחד עד 1 ליטר. ערבבו את התמיסה במרץ על ידי הנחת הבקבוק על צלחת ערבוב מגנטית עד להמסת האבקה.
      3. לצלחות אגר BHI, הוסיפו 37 גרם אבקת BHI ו-15 גרם אגר מגורען (ראו טבלת חומרים) בבקבוק השני והוסיפו מים אולטרה-טהורים עד 1 ליטר. ערבבו את התמיסה במרץ על ידי הנחת הבקבוק על צלחת ערבוב מגנטית עד להמסת האבקה.
      4. הבריגו את מכסי הצלוחיות לא חזק מדי ובצעו אוטוקלאבים לתמיסות באמצעות הגדרת הנוזל או בהתאם למפרט האוטוקלאב.
      5. הסר את התמיסה מן autoclave, ולאחר מכן לקרר את תמיסת agar-BHI ל 55 ° C. אם המדיה BHI בבקבוק 1 L נשמרת סטרילית, ניתן להשתמש בה עד חודש.
      6. כדי להכין את צלחות האגר-BHI של החיידקים, יש להוסיף תחילה אנטיביוטיקה, במידת הצורך, לבקבוק המכיל BHI ואגר (בהתאם לזני החיידקים שיש לגדל). הניחו את הבקבוק בקצרה על צלחת ערבוב מגנטית כדי לאפשר ערבוב מהיר.
         הערה: האנטיביוטיקה המשמשת כאן היא ספציפית לזני Lm המשמשים, אך ניתן להשתמש בכל אנטיביוטיקה הכרחית בצלחות BHI-agar. הוספנו סטרפטומיצין לריכוז של 200 מק"ג/מ"ל וכלוראמפניקול לריכוז של 7.5 מק"ג/מ"ל מכיוון שזני 10403S Lm עמידים לסטרפטומיצין. זנים אלה צומדו עם פלסמיד המכיל את מסגרת הקריאה הפתוחה chloramphenicol אצטילטרנספראז, ומכאן העמידות לכלורמפניקול.
      7. יוצקים את התערובת לצלחות תרבית חיידקי פוליסטירן בקוטר 10 ס"מ (כ-20 מ"ל לצלחת). כדי להיפטר מבועות, להבעיר את פני השטח העליונים של הלוחות לזמן קצר. מצננים את הצלחות למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
      8. למחרת, אטמו את הצלחות היבשות ואחסנו אותן ב -4 מעלות צלזיוס.
2. זיהום של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים אנושיים עם מונוציטוגנים של ל.
   1. שלושה ימים לפני ההדבקה, יש להוציא את זן ה-Lm לשימוש ממלאי גליצרול (מאוחסן בטמפרטורה של -80°C) על צלחת BHI-agar המכילה 7.5 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול ו-200 מק"ג/מ"ל סטרפטומיצין, במידת הצורך.
      הערה: הזן שיש לפסים יכול להיות מסוג פראי או מוטנטי, המבטא פלואורסצנטיות (עבור צביעה חיסונית JAT1045 שימש) או מבטא פלואורסצנטיות תחת מקדם ActA (עבור ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופ כוח משיכה JAT983 או JAT985 שימשו).
   2. לדגור צלחות ב 37 ° C עד מושבות בדידים נוצרות (1 - 2 ימים).
   3. יום לפני ההדבקה, לגדל את הזן הרצוי במשך הלילה, לנער אותו ב 150 סל"ד ב 30 ° C במדיה BHI עם 7.5 מיקרוגרם / מ"ל של chloramphenicol (במידת הצורך).
      1. מניחים 5 מ"ל של מדיה BHI בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל, מוסיפים 7.5 מיקרוגרם / מ"ל של כלוראמפניקול (במידת הצורך), ולאחר מכן מחסנים מושבה אחת מצלחת האגר באמצעות קצה סטרילי של 10 μL.
   4. למחרת, ממש לפני ההדבקה, מדדו את הצפיפות האופטית של תמיסת החיידקים ב-600 ננומטר (OD600) על ידי דילול הדגימה ביחס של 1:5; השתמשו בקובט המכיל BHI בלבד כדי לשמש כחסר.
   5. דללו את תרבית הלילה ל-OD600 של 0.1 ודגרו עליה, תוך ניעור במשך שעתיים בטמפרטורה של 30°C, במדיה BHI עם 7.5 מיקרוגרם/מ"ל של כלוראמפניקול (במידת הצורך) כדי לאפשר לחיידקים להגיע לצמיחה בשלב הלוג.
   6. מדוד את OD600 של תמיסת החיידקים, אשר צפוי להיות סביב 0.2-0.3. אם OD600 גבוה יותר, לדלל אותו ל 0.2 - 0.3 עם BHI בלבד.
   7. קח 1 מ"ל של תמיסה חיידקית לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. סובבו אותו במשך 4 דקות במהירות של 2,000 x גרם באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת החיידקים ב 1 מ"ל של PBS כיתה תרבית רקמה, במכסה המנוע של תרבית הרקמה. שטפו את החיידקים פעמיים נוספות על ידי סיבובם במשך 4 דקות במהירות של 2,000 x גרם בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ו resuspend את החיידקים ב 1 מ"ל של PBS.
   8. הכן את תערובת הזיהום על ידי ערבוב 10 או 50 μL של חיידקים מרחפים מחדש PBS עם 1 מ"ל של MCDB-131 מדיה מלאה עבור ריבוי של זיהום (MOI; כלומר, מספר החיידקים לתא מארח) של כ-50 חיידקים לתא מארח או 10 חיידקים לתא מארח.
   9. הסר את התקשורת מהבארות של לוחות 24 בארות, נזהר לא להפריע הידרוג'לים או את התאים. לשטוף את התאים 1x עם 1 מ"ל של MCDB-131 מדיה מלאה ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של חיידקים לכל באר.
   10. שמור על תערובת זיהום מסוימת (לפחות 100 μL) לקביעת MOI (ראה שלב 3.3).
   11. מכסים את הצלחת במכסה שלה ועוטפים את הצלחות בניילון פוליאתילן כדי למנוע דליפה. מניחים את הלוחות בצנטריפוגה ומסובבים את הדגימות במשך 10 דקות ב 200 x גרם כדי לסנכרן את הפלישה. מעבירים את הצלחות לאינקובטור תרבית הרקמה ודגרים עליהן למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   12. שטפו את הדגימות 4x עם מדיה מלאה MCDB-131 והעבירו אותן לחממת תרבית הרקמות. לאחר 30 דקות נוספות, החלף את המדיה במדיה בתוספת 20 מיקרוגרם / מ"ל של גנטמיצין.
3. קביעת ריבוי ההדבקה (MOI)
   1. במהלך הדגירה הראשונית של 30 דקות של תאי המאכסן עם החיידקים, הכינו דילולים סדרתיים פי 10 של תערובת הזיהומים כדי לקבוע את MOI. בצע דילולים פי 10 על ידי ערבוב 100 μL של תערובת זיהום עם 900 μL של 1x PBS (דילול ^10-1). לאחר מכן, מערבבים 100 μL של דילול ^10-1 עם 900 μL של PBS (דילול ^10-2).
   2. המשך עד לקבלת דילול ^10-5.
      הערה: יש לערבב היטב את כל הפתרונות לפני דילולם, ויש להשתמש בטיפים טריים ונקיים של פיפטה בכל שלב.
   3. לאחר ביצוע הדילולים, מניחים 100 μL מתוך ^10-2 - ^10-5 דילולים במרכז לוחות BHI/agar/chloramphenicol/streptomycin (במידת הצורך).
   4. צור מפזר מפיפטת זכוכית על ידי שימוש באש כדי לכופף את פיפטה כדי ליצור וו. טובלים את פיפטה באתנול 100% לעיקור ואז שורפים את האתנול בלהבה.
   5. לאחר שהמפזר התקרר, מפזרים את דילולי החיידקים בצורה הומוגנית על הצלחות החל מדילול ^10-5 ועוברים לתערובות מרוכזות יותר. לדגור את הצלחות הפוך ב 37 ° C במשך 2 ימים.
   6. בהתאם לצפיפות המושבה, לקבוע את מספר המושבות של ^10-3 ו ^{10-4 או 10-4} ו ^10-5 לוחות דילול. חשב את MOI כדלקמן:
      מספר מושבות × גורם דילול ÷ נפח נוסף ראשוני = מספר יחידת יצירת מושבה (CFU) לכל μL
      מספר CFU לכל μL נפח × של תערובת חיידקים לכל באר = מספר CFU לכל באר
      מספר CFU לבאר × נפח תאים לבאר = מספר חיידקים לתא
      הערה: CFU מייצג יחידות יוצרות מושבה.
   7. ממוצע MOIs משני לוחות כדי לקבל את MOI הסופי.

4. מיקרוסקופ כמותי בהילוך מהיר להערכת קשיחות מטריצה חוץ-תאית

הכינו את ההידרוג'לים של הרשות הפלסטינית על צלחת בת 24 בארות (ראו שלב 1), זרעו תאי HMEC-1 (ראו שלב 2), וגדלו בן לילה תרביות JAT983 כמתואר לעיל (ראו שלב 3).

1. ביום ההדבקה, להכין את תערובת זיהום על ידי ערבוב 10 μL של גלולה חיידקית לכל מ"ל של MCDB-131 מדיה מלאה. בזהירות להסיר את התקשורת מן הבארות של לוחות 24 בארות, ולהוסיף 1.9 מ"ל של מדיה מלאה MCDB-131 ו 0.1 מ"ל של תערובת חיידקים לכל באר.
   הערה: ה-MOI הנמוך יותר המשמש בבדיקה זו נחוץ לניתוח אירועי הפצה המתחילים מחיידק יחיד הפולש לתא מארח.
2. כסו את הצלחת במכסה שלה ואטמו אותה בניילון נצמד כדי למנוע דליפה. מניחים את הלוחות בצנטריפוגה ומסובבים את הדגימות במשך 10 דקות ב 200 x גרם כדי לסנכרן את הפלישה.
3. מעבירים את הצלחות לאינקובטור תרבית הרקמה ודגרים עליהן למשך 5 דקות.
4. לשטוף את הדגימות 4x עם מדיה ולהעביר אותם לאינקובטור תרבית רקמות. לאחר 5 - 7 דקות נוספות, החלף את המדיה במדיה בתוספת 20 מיקרוגרם / מ"ל של גנטמיצין.
5. דגור על הצלחת באינקובטור למשך 5 שעות נוספות כדי לאפשר למקדם actA להפעיל ולהניע את הביטוי של מסגרת הקריאה הפתוחה mTagRFP.
6. הכינו מדיום מיקרוסקופיה חיה על ידי השלמת L-15 של לייבוביץ' עם 10% נסיוב בקר עוברי, 10 ננוגרם/מ"ל של גורם גדילה אפידרמלי, ו-1 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון.
   הערה: L-15 כבר מכיל 2 mM L-גלוטמין, ולכן אין צורך להוסיף תוספת כמו במקרה של מדיה MCDB-131.
7. יש לערבב 1 μL של 1 מ"ג/מ"ל צבע Hoechst עם 1 מ"ל של L-15 מדיה מלאה ולהוסיף אותו לכל באר כדי להכתים את גרעיני התאים. מניחים את התאים באינקובטור תרבית הרקמה למשך 10 דקות ולאחר מכן מחליפים בכל באר את המדיה המלאה L-15 ב- 1 מ"ל של מדיה מלאה L-15 בתוספת 20 מיקרוגרם / מ"ל של גנטמיצין. כסו את הצלחת במכסה שלה והניחו אותה בתא הסביבתי של המיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים) במשקל של 37°C.
   הערה: לצורך הדמיה, נעשה שימוש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך עם מצלמת CCD (ראה טבלת חומרים) ומטרת אוויר פלואוריט 20X עם 0.75 NA. ההספק הוגדר ל-50% וזמן החשיפה ל-50 מילישניות. מסנני המיקרוסקופ המשמשים עבור mCherry הם 470/525 ננומטר לעירור ופליטה בהתאמה.
8. צלם מיקומים מרובים כל 5 דקות באמצעות תכונת מיקוד אוטומטי כדי לפקח על האופן שבו Lm מתפשט דרך חד-שכבות HMEC-1 שנזרעו על הידרוג'לים בעלי קשיחות משתנה.
   הערה: L-15 חוצץ עם HEPES, ולכן אין צורך להשתמש CO₂ במהלך ההדמיה.

טבלה 1. הרכב הידרוג'לים פוליאקרילאמיד (PA) בעלי קשיחות משתנה. בטבלה זו, אחוז תמיסת האקרילאמיד 40% ואחוז תמיסת ביס-אקרילאמיד 2% להשגת קשיחות נתונה (מודולוס יאנג, E) מסומנים בעמודות שונות.

המודולוס של יאנג (E, kPa)	אקרילאמיד % (מ-40% מלאי)	Bisacrylamide % (מ 2% מלאי)
0.6	3	0.045
3	5	0.075
10	10	0.075
20	8	0.195
70	10	0.45

Results

איור 1: בדיקת זיהום חיידקי של תאים מארחים השוכנים על הידרוג'לים דקים דו-שכבתיים של פוליאקרילאמיד משובץ חרוזים פלואורסצנטיים (PA) בעלי קשיחות משתנה. א.כיסויי זכוכית עוברים שינוי כימי כדי לאפשר חיבור הידרוג'ל. ב. 3.6 μL של תערובות PA מונחות על תחתיות הזכוכית. ג. התערובת מכוסה בכיסוי זכוכית עגול בקוטר 12 מ"מ המאפשר פילמור. ד. את הכיסוי מוסר עם מזרק מחט<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ריאגנטים
כדורי נתרן הידרוקסידי	פישר	S318-500
(3-אמינופרופיל)טריאתוקסיסילן	סיגמא	A3648
25% גלוטראלדהיד	סיגמא	G6257-100ML
40% אקרילאמיד	סיגמא	A4058-100ML
תמיסת ביס-אקרילאמיד (2%w/v)	פישר סיינטיפיק	BP1404-250
אמוניום פרסולפט	פישר	BP17925
טמד	סיגמא	T9281-25ML
סולפו-סנפה	פרוטאוכם	C1111-100 מ"ג
קולגן, סוג I תמיסה מחולדה	סיגמא	C3867-1VL
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	ג'יי טי בייקר	9224-01
HEPES, חומצה חופשית	ג'יי טי בייקר	4018-04
בינוני L-15 של לייבוביץ, ללא פנול אדום	תרמופישר	21083027
MCDB 131 בינוני, ללא גלוטמין	טכנולוגיות חיים	10372019
בסיס סרום בקר עוברי, לוט: A37C48A	תאומים ביו-פרוד	900108 500 מ"ל
גורם גדילה אפידרמיס, EGF	סיגמא	E9644
הידרוקורטיזון	סיגמא	H0888
ל-גלוטמין 200mM	פישר	SH3003401
DPBS 1X	פישר	SH30028FS
גנטמיצין סולפט	ביו-רפואי MP	194530
כלוראמפניקול	סיגמא	C0378-5G
אגר DifcoTM, מגורען	ב.ד.	214530
BBL TM עירוי מוח-לב	ב.ד.	211059
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate - 10 מ"ג / ul תמיסה במים	Invitrogen	H3570
0.25% טריפסין-EDTA , פנול אדום	תרמופישר	25200056
סטרפטומיצין סולפט	פישר סיינטיפיק	3810-74-0
ציוד מעבדה חד פעמי
כיסויי זכוכית עגולים 12 מ"מ	פישרברנד	12-545-81	מס' 1.5 כיסויים | קוטר זכוכית 10 מ"מ | לא מצופה
תחתית זכוכית 24 צלחות באר	מאטק	P24G-1.5-13-F
צלוחיות T-25	בז	353118
50 מ"ל צינורות חרוטיים	בז	352070
15 מ"ל צינורות חרוטי	בז	352196
פיפטות סרולוגיות חד פעמיות (1 מ"ל, 2 מ"ל, 5 מ"ל, 10 מ"ל, 25 מ"ל)	בז	357551
פיפטות זכוכית פסטר	VWR	14672-380
טיפים פיפטה (1-200 μl, 101-1000 μl)	דנוויל	עמ' 1122, עמ' 1126
כפפות בדיקה ללא אבקה	מיקרופלקס	XC-310
חיידקי Cuvettes	זארשטדט	67.746
סכיני גילוח	VWR	55411-050
מחט מזרק	ב.ד.	305167
בקבוקי עיקור 0.2um	תרמו סיינטיפיק	566-0020
מזרקים של 20 מ"ל	ב.ד.	302830
מסנני 0.2um	תרמו סיינטיפיק	723-2520
מקלות עץ	גריינג'ר	42181501
עטיפת סרן	סנטה קרוז ביוטכנולוגיות	SC-3687
צלחות חיידקים	בז	351029
ציוד מעבדה גדול/לא חד פעמי
הוד תרבית רקמות	אופה	SG504
המציטומטר	סיגמא	Z359629
אינקובטור חיידקים	תרמו סיינטיפיק	IGS180
אינקובטור תרביות רקמות	נואיר	NU-8700
תא ואקום/degasser	בלארט	42025	37°C ו-5% CO2
מיקרוסקופ הפוך Nikon Diaphot 200 epifluorescence	ניקון	ניקון-דיאפוט-200
אינקובטור כלוב	הייסון	מנהג
פיפטה אייד	דראמונד	4-000-110
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul)	גילסון	F144802, F123601 F123602
מד pH	מטלר טולדו	30019028
מלקחיים	FST	11000-12
1 ליטר בקבוק	פישרברנד	FB5011000
מכונת Autoclave	אמסקו	3021
מערבבים צלחת מגנט	בלקו	7760-06000
חטיפי ערבוב מגנטים	בלקו	1975-00100
ספקטרופוטומטר	בקמן	DU 640
תוכנה
תוכנת מיקרוסקופ (μManager)	הדמיה פתוחה
מטלב	Matlab Inc
פלוג'ו	FlowJo, LLC
תוכנה אוטומטית לניתוח תמונה, CellC	https://sites.google.com/site/cellcsoftware/		התוכנה זמינה באופן חופשי. ניתן להשיג קובצי הפעלה וקודי מקור של MATLAB בכתובת https://sites.google.com/site/cellcsoftware/