קביעת יעילות אנטי-ויראלית של תרופות ניסיוניות באמצעות בדיקת פלאק

תקציר

מקור: Yadavalli, T., et al. רקמת קרנית חזיר משתללת כדי לחקור את היעילות של אנטי-ויראלים של נגיף הרפס סימפלקס-1. J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים את השיטה לביצוע בדיקת פלאק באמצעות וירוס המתקבל מקרנית חזיר נגועה. קרנית החזיר משמשת לבדיקת היעילות האנטי-ויראלית של תרופות ניסיוניות.

פרוטוקול

1. כימות זיהום בווירוס

הערה: יש להעריך את טיטר הנגיף מקרניות חזיר מדי יום כדי לנתח את השפעת הטיפול התרופתי.

1. כדי לכמת את הנגיף, זרע תאי Vero בצפיפות של 5 x 10⁵ של תאים לבאר אם משתמשים בצלחת של 6 בארות כפי שנעשה בניסוי זה. עשו זאת יום לפני ההדבקה. דגרו על התאים המצופים למשך הלילה כדי להבטיח שהם מתכנסים לכימות הנגיף.
2. Aliquot 500 מיקרוליטר של מדיה נטולת סרום לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה מרובים. הכנס ספוגית סטרילית עם קצה כותנה טבולה בצינורות מלאים במדיה נטולת סרום. יש לטבול ולהרטיב את צמר הגפן לפחות 5 דקות לפני השימוש.
3. מבלי להפריע למדיה הבסיסית, העבירו את לוחית קרנית החזיר הנגועה לארון בטיחות ביולוגית. בעזרת צמר גפן רטוב יש לבצע 3 סיבובים עם כיוון השעון ו-3 סיבובים נגד כיוון השעון בקוטר של 5 מ"מ ממרכז קרנית החזיר הנגועה מבלי להפעיל לחץ מוגזם.
4. הכנס בחזרה את צמר הגפן לתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה המלא במדיה נטולת סרום וסובב אותו עם כיוון השעון ונגד כיוון השעון 5 פעמים. יש לקצר את קצה המתכת של צמר גפן כך שיתאים לחלוטין לצינור מיקרו-צנטריפוגה וניתן יהיה לסגור את המכסה.
5. הנח את צינור המיקרו-צנטריפוגה המכיל את קצה הכותנה הספוגית על מכונת מערבולת ומערבולת במהירות גבוהה למשך דקה אחת.
6. בצע כימות וירוס באמצעות בדיקת פלאק על דגימות אלה.
   הערה: שלב כימות זה צריך להתבצע בימים 2, 4, ואופציונלי ב-6 ימים לאחר ההדבקה.

2. כימות וירוסים על ידי בדיקת פלאק

הערה: כדי לבצע בדיקת פלאק, גדל וצלחת תאי Vero לצלחת של 6 בארות וודא מפגש של 90% של תאים לפני תחילת הבדיקה. השתמש בבקבוק מתכנס של 75 ס"מ² של תאים אלה. כל השלבים שלהלן צריכים להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית.

1. שטפו את השכבה החד-שכבתית של תאי Vero בבקבוק עם 10 מ"ל של מי מלח מאגר פוספט טרי (PBS) לאחר שאיבת מדיום התרבית. חזור על שלב הכביסה שוב עם PBS לאחר שאיבת הסט הראשון של תמיסות הכביסה.
2. הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין לשכבת התא החד-שכבתית. דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. בעין בלתי מזוינת, ודא שהתאים מנותקים מהמשטח הפנימי של הבקבוק. אם לא, המתן עוד 5 דקות לפני שתבחן שוב את הבקבוק. כאשר נראה שהתאים מנותקים, הוסף 9 מ"ל של מדיה שלמה לשכבה החד-שכבתית כדי להבטיח שהתאים יתנתקו לחלוטין ממשטח הבקבוק.
3. אוספים את כל התאים מהבקבוק יחד עם כל המדיה ומניחים אותם בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
4. עבור כל באר מ -6 לוחות הבאר המשמשות לבדיקת רובד, השתמש ב -300 מיקרוליטר מצינור הצנטריפוגה. מלאו כל באר של צלחת 6 הבארות ב-2 מ"ל של מדיה שלמה. השאירו את הצלחות בחממה למשך הלילה כדי לאפשר להן לצמוח וליצור שכבה חד-שכבתית בכל באר.
5. על מנת לבצע בדיקת פלאק, יש לבצע דילול סדרתי של דגימות לפני כימות הנגיף.
6. בצע דילול log101 fold של הנגיף בשפופרות מיקרו-צנטריפוגות באמצעות מדיה נטולת סרום עד שמגיעים לדילול של 10^-8. כאשר בדילול של 10^-3, מעבירים 1 מ"ל מהדילול לשכבה החד-שכבתית של תאים מצופים לאחר שאיבת אמצעי הגידול על התאים מצלחת 6 הבארות, זה יהיה שלב ההדבקה. דגרו את הצלחת הנגועה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
7. שאפו את אמצעי הזיהום הקיימים, שטפו עם PBS פעמיים בעדינות לציפוי התאים, והוסיפו 2 מ"ל של חומר עמוס במתיל צלולוז לכל באר לכל 6 הבארות. דגירה למשך 72 שעות או עד שניתן לראות היווצרות פלאק. ניתן לזהות פלאק על ידי היווצרות פערים קטנים בין תאים בחד-שכבת התא.
8. הוסף 1 מ"ל מתנול לאט לפינה של כל באר, תוך שימוש בקיר כקצה מנחה. דוגרים את צלחת 6 הבארות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. שאפו לאט את התוכן של כל באר מהצלחת מבלי להפריע או לעורר את שכבת התא החד-שכבתית.
9. הוסף 1 מ"ל של תמיסת עבודה סגולה קריסטל לכל באר של צלחת 6 בארות, וודא שכל התאים מכוסים. דגרו את צלחת 6 הבארות בחושך למשך 30 דקות. השליכו את תמיסת הקריסטל הסגולה על ידי שאיפתה וייבשו את הבארות על דף נייר סופג.
10. ספרו את מספר הפלאקים בבאר הדילול הגבוהה ביותר כדי לכמת את תכולת הנגיף הכוללת בתמיסה ההתחלתית. חזור על התהליך פעמיים כדי לאשר את הטיטר הנגיפי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
30 G מחטים תת-עוריות.	BD	305128
בקבוק זכוכית 500 מ"ל.	תומאס סיינטיפיק	844027
ארון בטיחות ביולוגית עם הסמכת Bio-Safety Level-2 (BSL-2).	תרמופישר סיינטיפיק	Herasafe 2030i
Calgiswab 6 אינץ' סידן אלגינט סטרילי ספוגיות סטנדרטיות.	פוריטני	22029501
מגרד תאים - 25 ס"מ	Biologix BE	70-1180 70-1250
צינור צנטריפוגה
סגול קריסטל	סיגמא אולדריץ'	C6158	אחסני את האבקה במקום חשוך
מדיום הנשר המותאם של דולבקו - DMEM	גיבקו	41966029	יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש
אתנול	סיגמא אולדריץ'	E7023
סרום בקר עוברי -FBS	סיגמא אולדריץ'	F2442	מכניסים לצינורות של 50 מ"ל ושומרים קפואים עד לשימוש
תאי Vero	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאי ATCC	CRL-1586
מכונת מערבולת
מתנול
מתיל צלולוז
צינור מיקרוצנטריפוגה
קרניות חזיר	פארק אריזות ושות', שיקגו, אילינוי		הזמנה מיוחדת לפי בקשה
כיסויי ספסל נוהל - לפי הצורך.	תרמופישר סיינטיפיק	S42400
פיפטות סרולוגיות	תומאס סיינטיפיק	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
ציוד פיפטינג סרולוגי.	תומאס סיינטיפיק	Ezpette Pro
סטריאוסקופ	קרל זייס	SteREO Discovery V20
צלוחיות תרבית רקמה, T175 סמ"ר.	תומאס סיינטיפיק	T1275
אינקובטורים לתרבית רקמה שיכולים לשמור על 5% CO2 וטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס	תרמופישר סיינטיפיק	Forma 50145523
צלחות מטופלות בתרבית רקמות (6 בארות).	תומאס סיינטיפיק	T1006
טריפסין