בדיקה לקביעת התחלת ביופילם רב-מיקרוביאלי על תאים נגועים בנגיף

תקציר

מקור: Plotkin, B. J. et al., קביעת התחלת ביופילם על תאים נגועים בנגיף על ידי חיידקים ופטריות. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה ממחיש את התחלת היווצרות ביופילם רב-מיקרוביאלי על תאים נגועים בנגיף על ידי חיידקים ופטריות. זיהום וירוס הרפס סימפלקס מעכב את ההתקשרות החיידקית לתאים, ומונע לוקליזציה משותפת חיידקית-פטרייתית. לעומת זאת, תאים לא נגועים מציגים קו-לוקליזציה חיידקית-פטרייתית וייזום של היווצרות ביופילם.

פרוטוקול

1. זני HSV וטיפול

בהם

NOTE: רקומביננטי שאינו מתפשט HSV-1(KOS) gL86 ו- HSV-2 (KOS) 333gJ^- עם פעילות כתב בטא-גלקטוזידאז משמש לבדיקה.

1. יש להשתמש בווירוס מכמות בודדת ולאחסן בטמפרטורה של -80°C ביחס של 1:1 של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 20% נסיוב בקר עוברי (FBS) וחלב רזה עד לשימוש. לפני אחסון לוט ויראלי, לקבוע את ריכוז הנגיף על ידי o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) ו 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) assay.
2. קביעת כדאיות הנגיף וריבוי ההדבקה (MOI) על-ידי צביעת X-Gal עבור כל בדיקה ניסיונית שבוצעה באמצעות בדיקת כניסת וירוסים של כתב, כפי שתואר קודם לכן (איור 1).
3. דילול וירוס (Opt-MEM) ל-MOI הרצוי. יש לתקן חד-שכבות (פרפורמלדהיד; 0.5 מ"ל/באר) לפני הצביעה. מקם בקרות כדאיות וירוסים בצלחת מיקרוטיטר נפרדת במקביל ללוחות בדיקה פולימיקרוביאליים.

2. טיפול בתאי HeLa 299

1. גדל ב-37°C, 5%_CO2 ב-DMEM עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), גנטמיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל) ו-L-גלוטמין. תאי מעבר במפגש של 80% עם תמיסת טריפסין (חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית, 0.53 M EDTA; 0.05% טריפסין; 5 מ"ל/צלוחיות).

3. C. albicans טיפול

הערה: C. albicans המתקבל ממקור מעבדה קליני מאוחסן ב -80 °C בחלב רזה Remmel 2x בינוני.

1. תרבית מלאי קפוא על Sabouraud דקסטרוז בינוני (37 ° C). לאחר 24 שעות תת-תרבית C. albicans על פטריות בינוניות (37 ° C; 48 שעות) לשימוש.
2. צור צורות צינור נבט (GT) (בחר מושבות מייצגות; 3 מ"ל FBS; 3 שעות; 37 ° C; ספיגה₆₀₀ (Abs₆₀₀), 0.3). לאחר הדגירה, שוטפים GT (תמיסת מלח מאוזנת של הנקס, HBSS; פי 2; 4,000 x גרם). הוסף GT שטוף HBSS מחומם (37 ° C; 0.32 Abs₆₀₀). צורות GT צריכות להיות 99% מהתאים שנצפו כפי שנקבע על ידי ספירת ההמוציטומטר.
3. הכינו תרחיפים בצורת שמרים (YF) על ידי בחירת מושבות פטריות מייצגות (HBSS, 3 מ"ל; 0.32 Abs₆₀₀). ספור את מספר צורות YF / ml מיקרוסקופית באמצעות המוציטומטר. צורות YF צריכות להיות 99% מהתאים שנצפו כפי שנקבע על ידי ספירת ההמוציטומטר.
4. הפוך ציר פטרייתי עובד (250 μl של GT או YF מלאי ב 25 מ"ל HBSS; 37 ° C; 10⁵ יחידה ליצירת מושבה, (CFU/ml)

4. טיפול ב- S. aureus

1. חנות S. aureus American Type Culture Collection, ATCC 25923 ( -80 ° C; חלב רמל רזה פי 2). תרבית על אגר דם כבשים (5%; 37 מעלות צלזיוס; 24 שעות). בחר מושבות ייצוגיות והעבר למלחי מניטול בינוניים תוך יומיים למלאי (37 ° C; 18 שעות).
2. הפוך S. aureus מלאי השעיה (3 מ"ל HBSS; 1.32 Abs_{600 ;}10⁸ CFU / מ"ל)
   1. הפוך את S. aureus עובד ציר (100 μl של המלאי ב 25 מ"ל HBSS; 10⁵ CFU/ml).

5. קנדידה ו- S. aureus השעיות

1. הכינו תרחיף מעורב של C. albicans ו-S. aureus (250 μl YF או GT stock ו-100 μl S. aureus stock ב-25 מ"ל HBSS).

6. בדיקת ביופילם פולימיקרוביאלית

1. זרעים 96 צלחות באר עם 200 μl של 2 x 10⁵ תאי HeLa / מ"ל (85% רמת מפגש). לוחות סלע (30 - 45 דקות; 37 ° C) לפני הדגירה (37 ° C; 5% CO₂ אינקובטור; 18 שעות). לשטוף monolayers (1x; Opt-MEM) ואז זרע עם HSV (HSV-1 (KOS) gL86 או HSV-2 (KOS) 33 gJ^- ב 100 μl Opt-MEM ; MOI 50 ו 10). צלחות דגירה (3 שעות; 37 ° C; 5% CO₂). יש להשתמש רק בזן ויראלי אחד ביום.
2. יש לשטוף חד-שכבות נגועות (1x; מלוחים חוצצי פוספט (PBS) עם Mg⁺² ו-Ca⁺²; 100 μl). החלף PBS עם HBSS חם משאיר 25 μl בכל באר.
   1. הוסף מתלי עבודה YF, GT ו/או S. aureus (100 μl; יחס יעד לתא = 5:1; n=16) כמצוין בטבלה 1. לוחות דגירה (סטטיים; 30 דקות; 37°C; 5% CO₂).
3. לאחר הדגירה, יש לשאוף טור אחד בכל פעם ומיד למלא מחדש ב-300 μl PBS עם Mg⁺² ו-Ca⁺². חזור על שלב זה פעמיים ולאחר מכן הוסף חיץ ליזה לבדיקת משקעים חיסוניים רדיו (RIPA; מסנן מעוקר; 200 מיקרוליטר של דילול 1:50).
4. בצעו טריטורציה מהירה של הליזט של תאי HeLa ואז הניחו 50 μl על מלחי מניטול (MS) ו/או פטריות (F) (איור 2). מורחים את הליזט בעזרת מוט זכוכית כפוף בזווית של 90°. לדגור על הצלחות (18 שעות ב 37 ° C). ספור ידנית את מספר המושבות בכל צלחת. הבקרות מורכבות מדבקות S. aureus ו/או C. albicans לתאי HeLa לא נגועים ב-HSV.

טבלה 1. קביעת תבנית כללית של היצמדות מיקרוביאלית באינטראקציות מיקרוביאליות.GT= קנדידה אלביקנס פנוטיפ צינור נבט; YF = C. albicans שמרים טופס פנוטיפ; MSSA = סטפילוקוקוס זהוב רגיש למתיצילין; MS= מלחי מניטול בינוניים; F= מדיום פטריות.

תוצאות

איור 1. צילומי צביעת X-gal של זיהום HSV-1 תלוי מינון בתאי HeLa. תאי HeLa נגועים ב-HSV-1 ב-MOI ו-X-Gal שונים מוכתמים. (A) תאי HeLa בבאר של צלחת באר 96 עם בקרת תאי HeLa נגועים בדמה של X-Gal; הגדלה ראשונית פי 20; (B) תאי HeLa בבאר של צלחת באר 96 עם תא HeLa מוכתם X-Gal נגוע HSV-1 בריבוי זיהום (MOI) של 10; הגדלה ראשונית פי 20; (C) תאי HeLa בבאר של צלחת בא...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
C.albicans
BBL Sabouraud דקסטרוז	ב.ד.	211584
פטריות אגר	נקודה מדעית	7205א
ס.אוראוס
אגר מלח מניטול	טרוי ביולוגים	7143ב
אגר דם כבשים	טרוי ביולוגים	221239
תאי הלה
1xDMEM (מדיום הנשר המעובד של Dubelcco, עם 4.5 גרם / ליטר גלוקוז ו- L-גלוטמין, ללא נתרן פירובט	קורנינג	10-017-ס"מ
גנטמיצין 50 מ"ג/מ"ל	סיגמא	1397	ריכוז סופי של 50μg/ml ב-DMEM המלא
טריפסין EDTA (0.05% טריפסין, 0.53M EDTA)תמיסה 1X	קורנינג	25-052-CI
סרום בקר עוברי	אטלנטה ביולוגיה	S11150	ריכוז סופי של 10% ב-DMEM המלא
מדיום וריאגנטים אחרים
ONPG	תרמו סיינטיפיק	34055
גל X טהור במיוחד	Invitrogen	15520-018
1x HBSS (תמיסת מלח מאוזנת של הנקס)	קורנינג	20-021-CV
1XPBS	נקודה מדעית	30042-500
ריפא ליזיס	לייף טכנולוגיות	89901
אספקה
צלחות 96 באר	אוורגרין סיינטיפיק	222-8030-01F
צינורות תרבות 100x13	תומאס סיינטיפיק	9187L61