$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. פתרונות ומדיה
- הכינו 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 בינוני, מלח חוצץ פוספט (PBS), מרק דקסטרוז Sabouraud ואגר דקסטרוז Sabouraud לפי טבלה 1.
2. תנאי גידול פטרייתיים
- אחסנו את כל הזנים הפטרייתיים כמלאי קפוא ב-35% גליצרול בטמפרטורה של -80°C, עד לצורך.
- בצע את השלבים הבאים לפני כל ניסוי.
- לזני קנדידה אלביקנס:
- מפשירים בקבוקון מלאי ומעבירים 200 μL עד 10 מ"ל של מרק דקסטרוז Sabouraud בצינור פוליפרופילן סטרילי של 50 מ"ל עם מכסה ותרבית לילה ב 30 ° C עם תסיסה (200 סל"ד). זכרו להטות את הצינור ולהשאיר את הפקק פתוח מעט לאוורור טוב יותר של התרבית.
- עבור זני Cryptococcus neoformans:
- מגרדים את המשטח הקפוא של בקבוקון מלאי. צלחת את התאים על צלחות אגר דקסטרוז Sabouraud ולדגור במשך 48 שעות ב 30 ° C. לאחר צמיחה נראית לעין של מושבות מבודדות, לשמור את הצלחות במקרר (4 ° C) אטום עם סרט פרפין עד 15 ימים.
- אספו מושבה מבודדת בגודל בינוני מהצלחת באמצעות קיסם סטרילי או לולאת חיסון סטרילית וחסנו 10 מ"ל מרק דקסטרוז סאבורו בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל. יש לדגור במשך כ-24 שעות ב-30°C תחת תסיסה (200 סל"ד).
- אין לחרוג מהדגירה של 24 שעות. זכרו להטות את הצינור ולהשאיר את הפקק פתוח מעט לאוורור טוב יותר. זה תמיד טוב כדי סטנדרטיזציה של שלב הצמיחה של התאים לפני כל בדיקה, שכן זהו גורם חשוב המשפיע על עמידות מיקרוביאלית.
הערה: שתי הפטריות גודלו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס לצורך התפשטות מהירה בניסויים שלנו, אך ניתן לשנות את הטמפרטורה כדי לשקף את מטרות המחקר, למשל טיפול קליני (37 מעלות צלזיוס). והכי חשוב, יש לקבוע מראש את זמן הדגירה הראשוני הזה עבור כל מבודד פטרייתי ולשמור עליו לאורך כל הבדיקות כדי להבטיח יכולת שחזור.
- לאחר גידול פטרייתי, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה צינורות חרוטי ב 1,200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט והוסיפו 10 מ"ל PBS.
- השהה שוב את התאים והצנטריפוגה במהירות של 1,200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- חזור על שטיפת PBS וצנטריפוגה פעמיים נוספות. לאחר השטיפה השלישית, להשעות מחדש את התאים ב 5 מ"ל (על פי גודל הכדור) של 2X RPMI-1640 בינוני.
- הכן 1 מ"ל של דילול 1:100 או 1:1,000 בצינור מיקרוצנטריפוגה (בהתאם לעכירות של תרחיף התא).
- Aliquot 10 μL של דילול זה, מניחים אותו בחדר hemocytometer ולספור את המספר הכולל של תאים בארבעת רבעי הפינה תחת המיקרוסקופ. חשב את הריכוז לפי הנוסחה: (מספר תא כולל/4) x מקדם דילול x 104 (קבוע דילול התא).
- שקול כדאיות של 100% אם ספירת הכדאיות ותנאי הגידול נמצאו בקורלציה שיטתית עבור המבודד הנחקר.
הערה: הסטנדרטיזציה ובקרת האיכות של ספירות הכדאיות יכולות להיעשות על ידי ציפוי אחורי בהתאם לשיטת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של הוועדה האירופית לבדיקת רגישות מיקרוביאלית (EUCAST) לשמרים.
- אם לא נקבע מתאם גדילה/כדאיות עבור המבודד הנחקר, מדדו את הכדאיות הפטרייתית על ידי ספירת תאים חיים בהמוציטומטר בעזרת צבעים שצובעים תאים מתים באופן סלקטיבי, כגון פלוקסין B11, כחול טריפאן או ג'אנוס גרין. השתמש בתאים פטרייתיים לפרוטוקול זה רק אם יכולת הקיום של האוכלוסייה בשלב זה היא 90% ומעלה.
הערה: צבעים מתים/חיים עשויים שלא לעבוד טוב עם הפטרייה המועדפת. אנא בדקו אותם לפני השימוש. לדוגמה, הצבע הכחול טריפאן לא עובד טוב עם C. neoformans.
- לאחר מכן, להכין את מתלי התא ב 2X RPMI-1640 בינוני (2X מותאם inoculum ב RPMI-1640 בינוני). עבור צלחות 96 באר לשקול נפח של 5 מ"ל עבור כל צלחת.
- עבור כל זני C. albicans, הכינו תרחיף תאי מלאי של 4 x 103 תאים/מ"ל. ריכוז זה הוא פי 2 מריכוז התאים הסופי בכל באר (2 x 103 תאים / מ"ל).
- עבור זני C. neoformans, הכינו תרבית מלאי של תאים 2 x 104 תאים/מ"ל. ריכוז זה כפול מריכוז התאים הסופי בכל באר (1 x 104 תאים / מ"ל).
- עבור פטריות אחרות, לבדוק עם אנטי פטרייתי ידוע איזה ריכוז יהיה אידיאלי עבור המחקר מסוים ביחס לזמן הדגירה. קחו בחשבון את חילוף החומרים ואת זמן הכפילות של הפטרייה.
3. פפטידים (סוכן לא ידוע)
- אחסנו את הפפטידים הליופיליים בטמפרטורה של -20°C, והמיסו אותם במים שעברו דה-יוניזציה לפני כל ניסוי. זמן האחסון המרבי לאחר המסתו במים יהיה תלוי באופיו של כל פפטיד.
- הכינו אליציטוטים של פי שניים מהריכוז הסופי הגבוה ביותר שנבדק בבדיקה (2X). באופן אידיאלי, להכין מספר קטן של aliquots עם מספיק פפטיד לשימוש חד פעמי כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה.
הערה: בחירת הריכוז צריכה להתבסס על ספרות ועל תכונות הפפטיד. מומלץ להתחיל את דילולים סדרתי עם כ 100 מיקרומטר של פפטיד ולאחר מכן להקטין או להגדיל את טווח ריכוז זה בהתאם לתוצאות שהתקבלו.
4. הפניה אנטי פטרייתיות (בקרות חיוביות)
- למי שמדולל במים: הכינו תמיסה פי 2 בריכוז הגבוה ביותר של האנליזה (ראו סעיף 5: בדיקה אנטי פטרייתית לשלבי הדילול).
- עבור זני C. albicans, הכינו תמיסה של 128 מיקרוגרם/מ"ל של פלוקונזול או 128 מיקרוגרם/מ"ל של קספונגין. ריכוז הצלחת עבור שניהם יהיה 64 מיקרוגרם / מ"ל.
- עבור זני C. neoformans, הכינו תמיסה של 32 מיקרוגרם/מ"ל של אמפוטריצין B (תמיסה מסיסה במים). ריכוז הצלחת יהיה 16 מיקרוגרם / mL.
הערה: בדרך כלל אמפוטריצין B מדולל בדימתיל סולפוקסיד (DMSO), מאחר שאנטי-פטרייתי זה מסיס בצורה גרועה במים. עם זאת, קיימים תכשירי אמפוטריצין B מסיסים במים הזמינים באופן מסחרי.
- עבור antifungals מדולל בממס אורגני: להכין פתרון מלאי 100X ב DMSO, ולאחר מכן לדלל אותו 10X במים לשימוש.
הערה: לכן, בבאר, הריכוז הסופי של DMSO לא יעלה על 1%. באר שבה הפטרייה תגדל במדיה המכילה 1% DMSO כשליטה נדרשת בהתחשב בכך שפטריות מסוימות אינן סובלות היטב ריכוז זה של הממס. זכור כי DMSO הוא photoensitive, אז לכסות את הצלחת עם נייר כסף או מניחים אותו בתא כהה למשך תקופת הדגירה.
5. בדיקה אנטי פטרייתית
הערה: בדיקות אנטי פטרייתיות במבחנה מבוצעות על בסיס בדיקת רגישות מיקרודילולציה של מרק מהנחיות M27-A3 של מכון התקנים הקליני והמעבדה (CLSI) עם שינויים מסוימים.
- הכינו דילול סדרתי כפול של כל פפטיד ושלטו במיקרו-צלחות פוליסטירן של 96 בארות עד לנפח סופי של 50 מיקרוליטר.
- בעזרת פיפטה מוסיפים 100 μL של האנטי פטרייתי/פפטיד בריכוז פי 2 מהריכוז הסופי הגבוה ביותר הרצוי בעמודות 1-3, בשורה A.
- באמצעות פיפטה רב ערוצית, להוסיף 50 μL של מים סטריליים לתוך בארות אחרות, בשורות B עד H.
- הסר 50 μL של הבארות עם הריכוז הגבוה ביותר (שורה A), להעביר לבאר הבאה של הריכוז הבא (שורה B) הומוגניזציה.
- חזור על השלבים לעיל עד הבאר עם הריכוז הנמוך ביותר ולהשליך 50 μL של באר זו (שורה H). השאר את עמודות 11 ו- 12 (שורות A, B, C) עם מים בלבד עבור בקרה ריקה או בקרת שלילית/צמיחה.
- הוסף 50 μL של 2X מותאם inoculum בתווך RPMI-1640 לכל באר (עמודות 1-3 ועוד עמודה 11 (שלילי/בקרת גדילה)); הריכוז הסופי עבור C. albicans יהיה 2 x 103 תאים/מ"ל, והריכוז הסופי עבור זני C. neoformans יהיה 104 תאים/מ"ל.
- הכינו פקדים ריקים (50 μL מים + 50 μL 2X RPMI-1640 בינוני ללא תאים) ובקרת גדילה שלילית (50 μL מים + 50 μL מותאם inoculum 2X RPMI-1640 בינוני ללא אנטי פטרייתי), והעמיסו לתוך צלחת הבאר כמתואר לעיל.
- חזור על ההליך עבור כל תרכובת להיבדק ואת הבקרה האנטי פטרייתית שנבחרה (עמודות 4-10).
הערה: הדילולים הסדרתיים יכולים להיעשות אנכית כמו הניסוי למטה, או אופקית בצלחת (כלומר, אם מספר הדילולים של התרכובת/תמצית הנתונה שיש לבדוק הוא שמונה או יותר).
- אם התרכובות, תרופות הייחוס או כל אחד ממרכיביו פוטוסנסיטיביים, בצעו את הבדיקה באור מופחת, כסו את הצלחות בנייר כסף, או הניחו בתא חשוך במהלך הדגירה.
- שקול את ההמלצות האופציונליות הבאות.
- אטמו את הצלחת עם צלחת כיסוי שקופה המאפשרת החלפת גזים, מכיוון שזה עוזר להפחית את האידוי.
- הניחו את הצלחת בתא לח; זה גם יעזור להפחית אידוי.
- יש לדגור על הלוחות בטמפרטורה של 37°C למשך 24 שעות או 48 שעות עבור כל זני C. albicans, ובמשך 48 שעות עם טלטול של 200 סל"ד עבור C. neoformans. הנפח הסופי הנמוך יותר (100 μL) מבטיח שלא תתרחש זליגה.
הערה: לא נצפה הבדל משמעותי בין קריאות מיקרופון ב-24 שעות ל-48 שעות עבור זני C. albicans. עם זאת, קריאות ב 48 שעות קל יותר לדמיין.
- התבוננו בכל הבארות, בעזרת מיקרוסקופ אופטי הפוך, לפני תקופת הדגירה ולאחריה כדי לאמת שינויים במורפולוגיה וכן כדי לבדוק סימני זיהום.
הערה: הקריאות יכולות להיעשות באופן ויזואלי ומצולמות בסוף הניסוי. לפני כל קריאה, הומוגניזציה מעט את הצלחת. הקריאות יכולות להתבצע גם על ידי מדידת OD שלה ב 600 ננומטר, אם גושי תאים או נימה אינם נצפים.
- בצע את הניסויים לפחות שלוש פעמים בתאריכים נפרדים.
טבלה 1. הכנת מדיה ומגיב.
| בינוני | הכנה |
| 2X מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 בינוני – 500 מ"ל | 10.4 גרם RPMI-1640 (בתוספת L-גלוטמין ופנול אדום; ללא ביקרבונט) |
| 330 mM 3-(N-morpholino) פרופאן חומצה סולפונית (MOPS) |
| כוונן ל-pH 7.0 עם NaOH |
| עיקור באמצעות סינון (מסנן 0.22 מיקרומטר) |
| פוספט מלח חוצץ (PBS) | 137 מ"מ NaCl |
| 2.7 mM KCl |
| 10 mM Na2HPO4 |
| 2 מ"מ ק"ש2ת"ד4 |
| Autoclave ב 121°C למשך 15 דקות. |
| מרק דקסטרוז Sabouraud | 15 גרם של אבקה ב 500 מ"ל של מים מזוקקים. |
| כוונן ל-pH 7.0 עם NaOH |
| Autoclave ב 121°C למשך 15 דקות. |
| Sabouraud דקסטרוז אגר | 32.5 גרם של אבקה ב 500 מ"ל של מים מזוקקים. |
| כוונן ל-pH 7.0 עם NaOH |
| Autoclave ב 121°C למשך 15 דקות. |