בדיקת ניצול ATP לקביעת הישרדות חיידקים תחת טיפול אנטיביוטי

תקציר

מקור: Wang, Liang-Chun, et al. בדיקה כמותית של רגישות לאנטיביוטיקה של אגרגטים של Neisseria gonorrhoeae באמצעות בדיקות מסחריות לניצול ATP וכתמים חיים/מתים. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר את בדיקת מדידת ה-ATP הפשוטה באמצעות מגיב זוהר לוציפראז. בדיקה זו משמשת לכימות הישרדות Neisseria gonorrhoeae לאחר טיפול עם ceftriaxone.

פרוטוקול

1. כימות כדאיות של צברי GC

1. לאסוף GC באמצעות מוליך סטרילי. ספוג GC מהצלחת והשהה מחדש את GC בציר שחומם מראש (GCP, טבלה 1) בתוספת 4.2% תמיסות NaHCO₃ ו-1% קלוג. השתמש בספקטרופוטומטריה באורך גל של 650 ננומטר (OD 650 של 1 = ~ 1 x 10⁹ CFU/mL) כדי לקבוע את ריכוז החיידקים המרחפים .
2. התאם את ריכוז GC ל~ 1 x 10⁸ CFU/mL.
3. הוסף 99 μL של מתלה GC מותאם לתוך בארות של צלחת 96 בארות.
4. לדגור על הצלחת במשך 6 שעות ב 37 ° C עם 5% CO₂ כדי לאפשר את החיידקים להצטבר.
5. הוסף 1 μL של ceftriaxone מדולל טורי (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0.2 מיקרוגרם / מ"ל) לתוך כל באר. השאירו כמה בארות לא מטופלות שישמשו כבקרות.
6. לדגור על הצלחת במשך 24 שעות ב 37 ° C עם 5% CO₂.
7. הפעילו את המתלים 3 פעמים בכל באר למשך 5 שניות בהספק של 144 ואט ו-20 קילוהרץ.
8. הוסף 100 μL של מגיב זוהר ATP זמין מסחרית לכל באר, פיפטה למעלה ולמטה במשך 3 פעמים, ודגרה במשך 15 דקות ב 37 ° C עם 5% CO₂.
9. העבירו בזהירות 150 מיקרוליטר תערובת מכל באר לבאר חדשה במיקרו-צלחת שחורה של 96 בארות והימנעו מהחדרת בועות.
10. מדוד את הספיגה של כל באר ב- 560 ננומטר באמצעות קורא הלוחות.
11. חשב את שיעור ההישרדות לפי היחס בין הקריאה המתקבלת לאחר טיפול סדרתי ceftriaxone לקריאה מבארות לא מטופלות.

2. אנליזה מיקרוסקופית פלואורסצנטית של חיים/מתים של אגרגטים GC

1. לאסוף GC באמצעות מוליך סטרילי. ספוג GC מהצלחת והשהה מחדש את GC במדיה GCP שחוממה מראש בתוספת תוספי 1% קלוג.
2. קבע את מספר החיידקים על ידי ספקטרופוטומטריה באורך גל של 650 ננומטר והתאם את ריכוז GC ל~ 1 x 10⁷ CFU/mL.
3. הוסף 198 μL של מתלי GC לתוך 8 באר מכסה תחתית תאים.
4. יש לדגור על התא במשך 6 שעות בטמפרטורה של 37°C עם 5%_CO2 כדי לאפשר היווצרות צבירה.
5. הוסף 2 μL של ceftriaxone (100 מיקרוגרם / מ"ל או דילולים שונים) לתוך כל באר בתוך כל תנאי צבירה. לדגור לזמן הרצוי ב 37 ° C עם 5% CO₂.
6. הוסיפו 0.6 מיקרוליטר של תערובת תמיסת כתמים חיים/מתים לכל באר ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂.
7. קבל תמונות מסדרת Z באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (ניתן להשתמש במיקרוסקופ מקביל).
8. נתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ למדידת גודל צברי GC ויחס עוצמת הפלואורסצנטיות FIR של צביעה חיה עד מתה בכל צבר.

טבלה 1: מתכון ל-1 ליטר של מצע גידול חיידקי GCP.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
100x תוסף קלוגס
אגר	ארצות הברית ביולוגי	A0930
בדיקת BacTiter	פרומגה	G8232
קפטריאקסון	TCI	C2226
בסיס בינוני Difco GC	ב.ד.	228950
ברזל חנקתי, נונאהידראט	סיגמא-אולדריץ'	254223-10 גרם
גלוקוז	תרמו פישר סיינטיפיק	BP350-1
BacLight צביעה חיה/מתה	Invitrogen	L7012
MS11 Neisseria gonorrhoeae			באדיבות ד"ר הרמן שניידר, המכון הצבאי למחקר ע"ש וולטר ריד
סוניקטור	קונטס		שווה ערך 9110001

זן