קביעת תפקידם של תאים דמויי נויטרופילים ברגישות תאי לימפומה לתרופה ניסיונית

תקציר

מקור: Hirz, T., et al. בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם ברגישות תאי לימפומה לסוכנים טיפוליים. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים בדיקה החוקרת את תפקידם של תאים דמויי נויטרופילים בהגנה על תאי לימפומה מפני ציטוטוקסיות של חומרים כימותרפיים. תרבית משותפת תלת-ממדית, המורכבת מלימפומה ותאים דמויי נויטרופילים, מוקמת ונחשפת לווינקריסטין – תרופה כימותרפית. מגע ישיר עם תאים דמויי נויטרופילים גורם upregulation של חלבונים אנטי אפופטוטיים בתאי לימפומה, ובכך לקדם את הישרדותם בנוכחות vincristine.

פרוטוקול

1. התמיינות של תאי HL60 לאורך המסלול הגרנולוציטי והתרבות המשותפת שלהם עם תאי לימפומה B RL במודל תלת ממדי

1. התמיינות של תאי פרומיאלוציטים אנושיים (HL60) לתאים דמויי נויטרופילים
   1. התאם את מספר התא HL60 ל- 3 x 10⁵ תאים/מ"ל ולאחר מכן הוסף 1 מיקרומטר חומצה רטינואית (RA) ו- 1.25% DMSO כדי לגרום להתמיינותם. זרעו כל 3 x 10⁵ תאי HL60 לכל באר בצלחת 48 באר ואז לדגור במשך 48 שעות ב 37 ° C עם 5% CO₂.
   2. מאוחר יותר, לאסוף את התאים ואת הצנטריפוגה ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. להשעות מחדש את התאים עם מדיום RPMI מלא לספירה באמצעות מונה כדאיות התא.
   3. לאחר מכן יש לדלל את תרחיף התאים בתווך סל"ד מלא כדי להתאים את מספר התא HL60 ל-3 x 10⁵ תאים/מ"ל ולגרום שוב להתמיינות שלהם על ידי הוספת 1 מיקרומטר חומצה רטינואית (RA) ו-1.25% דימתיל סולפוקסיד (DMSO). זרעו כל 3 x 10⁵ תאי HL60 לכל באר בצלחת 48 באר ודגרו במשך 48 שעות נוספות ב 37 ° C עם 5% CO₂.
2. ניתוח של בידול HL60 (HL60 diff)
   1. אספו את התאים וצנטריפוגו את הצינורות ב 300 גרם למשך 5 דקות ב- RT. השהה מחדש את הגלולה עם מדיום שלם של Roswell Park Memorial Institute (RPMI) לספירה באמצעות מונה כדאיות התא.
   2. לנתח את השינויים בסמני פני התא ביטוי לפי ציטומטריית זרימה. מקם כל 3 x 10⁵ תאי HL60 לא ממוינים (מתרבית תאים) ו- 3 x 10⁵ תאיHL60 diff בצינורות פלסטיק של 5 מ"ל לניתוח מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) וצנטריפוגה את הצינורות ב -300 גרם למשך 5 דקות ב- RT.
   3. יש להשהות מחדש את הכדוריות בסרום בקר עוברי (PBS) בנפח 50 μl פוספט-חוצץ מלח (PBS) (FBS) (4%). תייגו את התאים עם CD11b אנטי-אנושי מצומד ל-AF700 או CD38 אנטי-אנושי מצומד ל-APC (5 μl/10,⁶ תאים). לדגור על התאים בחושך במשך 30 דקות ב 4 ^oC.
   4. יש לשטוף עם 500 μl PBS-FBS (4%) ולאחר מכן לצנטריפוגה ב-300 גרם למשך 5 דקות ב-RT. להשהות מחדש את הכדוריות ב-200 μl PBS-FBS (4%).
   5. נתחו על ציטומטר זרימה באמצעות אסטרטגיית ה-gating של איור 1A והתצורה האופטית הבאה: לייזר 488 ננומטר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488/10BP); לייזר 633 ננומטר: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
   6. כדי לבחון את השינויים המורפולוגייםבדיפרנציאציה HL60, יש לשתק את התאים על שקופיות זכוכית לצורך בדיקה מיקרוסקופית.
      1. לשם כך, השהה מחדש כל 3 x 10⁴ תאי HL60 לא ממוינים (מתרבית תאים) ו- 3 x 10⁴ HL60diff בתווך סל"ד מלא של 150 μl. הרכיבו את שקופיות הזכוכית, כרטיסי הסינון ותאי הדגימה בצנטריפוגת הציטוספין וודאו שהצנטריפוגה מאוזנת.
      2. מקם כל סוג תא בתא דגימה וציטו-צנטריפוגה במהירות 1,500 סל"ד למשך 10 דקות ב-RT. הסר את השקפים, כרטיסי הסינון ותאי הדגימה מהצנטריפוגה. לפרק בזהירות, כדי לא לפגוע בתאים על השקופית. בטל כרטיסי סינון ותאים לדוגמה.
      3. הכתימו את התאים באמצעות ערכת צביעה Giemsa ושמרו את המגלשות למשך שעה לייבוש. בחנו את התאים במיקרוסקופ בהגדלה של פי 100.
3. תלת מימד (3D) תרבות
   הערה: ודא שהחומרים המשמשים בניסוי זה קרים והניסוי מתרחש על קרח.
   1. השהה מחדש כל 5 x 10⁴ תאי RL, לבד או מעורבב עם HL60diff ביחס RL:HL60diff 1:10, עם מטריצת קרום מרתף 300 μl באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל חתוך עם מספריים סטריליים על מנת להרחיב את הפתח לכ 2 עד 3 מ"מ. הימנע מבועות במהלך שלב זה.
   2. זרעו כל 300 מיקרוליטר של תרחיף התא / באר בצלחת 24 בארות. הימנע מבועות במהלך שלב זה. לדגור על הצלחת במשך 30 דקות ב 37 ° C עם 5% CO₂ ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל מדיום RPMI מלא עבור כל באר לדגור במשך 7 ימים ב 37 ° C עם 5% CO₂. החליפו את המדיום כל יומיים. הוסף 10 ננומטר vincristine ביום 5.
4. ניתוח FACS
   1. לאחר 7 ימים של תרבית, שואפים את המדיום ולשטוף כל באר עם 1 מ"ל PBS קר כקרח פעמיים. הוסף 3 מ"ל/באר של חומצה PBS-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) קרה כקרח (5 mM). נתקו את הג'ל מתחתית הבאר על ידי גירוד באמצעות תחתית קצה פיפטה 200 μl. נערו את הצלחת בעדינות על קרח במשך 30 דקות.
   2. מעבירים את תרחיף התאים לצינור סטרילי של 15 מ"ל ומנערים את הצינורות בעדינות על קרח למשך 30 דקות נוספות. בדוק את המראה של השעיית תאים הומוגנית. (אם זה לא המקרה, ואז לנער את התאים במשך זמן רב יותר או להוסיף PBS-EDTA יותר).
   3. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את הכדורים עם PBS ולאחר מכן צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב RT.
   4. יש להשהות מחדש עם PBS-FBS (4%) ותווית עם נוגדן CD19 אנטי-אנושי מצומד ל-PE-Cy7 ונוגדן CD38 אנטי-אנושי מצומד ל-APC (5 μl/10,⁶ תאים). לדגור בחושך במשך 30 דקות ב 4 ^oC.
   5. יש לשטוף עם 500 μl PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צינורות צנטריפוגות ב-300 גרם למשך 5 דקות ב-RT. להשהות מחדש את התאים עם Annexin V ו-PI באמצעות ערכה מסחרית.
   6. נתחו את הציטומטר של זרימה באמצעות אסטרטגיית ה-gating של איור 2A והתצורה האופטית הבאה: לייזר של 488 ננומטר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488/10BP), FITC (530/30 BP), PI (610/20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); לייזר 633 ננומטר: APC (660/20 BP). הבטיחו את פיצוי הצבע.

תוצאות

איור 1. פרמטרים מבניים של תאי HL60 ממוינים. (A) תרשימי פיזור קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC) מייצגים תאי HL60 ותאי HL60 ממוינים (HL60diff). (B) תאי HL60 ו-HL60diff סומנו ב-anti-CD11b-AF700 או anti-CD38-APC ולאחר מכן ניתוח ציטומטריית זרימה. לאחר התגברות על כל אוכלוסיית תאים בתרשים פיזור FSC-A לעומת SSC-A (A), התאים נותחו עבור הביטויים ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	21875-034
סרום בקר עוברי (FBS)	Gibco Invitrogen	10270-106
מלח חוצץ פוספט (PBS מכיל סידן ומגנזיום)	Gibco Invitrogen	14040-091
וינקריסטין	EG labo
מטריצת קרום מרתף BD Matrigel	BD Biosciences	354234	לשים על 4 מעלות צלזיוס לילה לפני יום הניסוי
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא-אולדריץ'	D8418
חומצה רטינואית	סיגמא-אולדריץ'	₪625
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא-אולדריץ'	A7906
חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA)	סיגמא-אולדריץ'	E5134
ערכת צביעה V-FLOUS מספחת	רוש	11 988 549 001
ערכת RAL 555 ערכת צביעת Giemsa שונה	קוסמוס ביו-רפואי	CB361550-0000
ציטומטריית זרימה LSRII	BD Biosciences
ציטוצנטריפוגה	תרמו סיינטיפיק
מיקרוסקופ Leica DMR-XA	לייקה מיקרוסיסטמס
מונה כדאיות תא T4 אוטומטי של Cellometer	Nexcelom Bioscience