בדיקה להערכת דומיננטיות חיסונית בתגובות לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T

תקציר

מקור: Choi, J. et al., Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8⁺ T Cell Responses. J. Vis. Exp. (2019)

הסרטון מציג בדיקה מבוססת ציטומטריה של זרימה להערכת דומיננטיות חיסונית בלימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T או בתגובות CTL. תאי מטרה פלואורסצנטיים מוזרקים מציגים פלואורסצנטיות משתנה המתאימה לאפיטופים אימונוגניים. איסוף ומיון לאחר הטחול חושפים ירידה בתאים פלואורסצנטיים בעוצמה גבוהה, מה שמאשר דומיננטיות חיסונית בתגובות CTL.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. חיסון עכברי C57BL/6 עם תאי גידול המבטאים T Ag

1. גדלו את קו תאי הפיברוסרקומה C57SV שעבר טרנספורמציה SV40 (או קו תאים דבק דומה של T Ag⁺) בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז ו-L-גלוטמין (1x) ובתוספת נתרן פירובט 1 מילימטר וסרום בקר עוברי 10% מומת בחום (FBS) בצלוחיות שטופלו בתרבית רקמות ב-37°C באטמוספירה לחה המכילה 10% פחמן דו-חמצני (CO₂).
2. ברגע שהתאים הופכים למשתלבים לחלוטין או מעט מתמזגים, הסירו והשליכו בעדינות את המדיום ושטפו את השכבה החד-שכבתית במי מלח סטריליים חומצים מראש (PBS).
   הערה: ביטוי T Ag מרבי מושג כאשר תאי T Ag⁺ מגיעים למפגש של 100%.
3. בתוך ארון בטיחות ביולוגי, הוסיפו חומצה טריפסין-אתילאנדיאמין-טראצטית שחוממה מראש (טריפסין-EDTA) (0.25%) כדי לכסות את השכבה החד-שכבתית בטמפרטורת החדר עד שהתאים נעקרים בטלאיים. הקש על הצדדים של צלוחיות התרבית מספר פעמים כדי לשחרר את התאים הדבקים הנותרים.
   הערה: במידת הצורך וכדי לזרז את תהליך הטריפסיניזציה, העבירו את הצלוחיות לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C. תאים שנעקרו ממקומם יאמצו במהירות צורה מעוגלת תחת מיקרוסקופ אור. שלב זה אמור להימשך כ -5 דקות.
4. הוסף 5 מ"ל של מדיום DMEM ולנתק גושים כדי להכין תרחיף חד תאי על ידי pipeting התוכן של כל בקבוק למעלה ולמטה.
5. העבירו את מתלה התא דרך מסננת תאים עם נקבוביות של 70 מיקרומטר לתוך צינור.
6. סובב את הצינור ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
7. השליכו את הסופרנטנט. להשהות תאים כדוריים ב 10 מ"ל של PBS סטרילי, קר.
8. חזור על שלבים 1.6 ו- 1.7 פעמיים.
9. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר. הכינו תרחיף אחיד המכיל 4 x 10⁷ תאים/מ"ל PBS סטרילי.
10. יש להזריק 500 μL של התרחיף הנ"ל תוך צפקי (כלומר) לכל עכבר בוגר (בן 6-12 שבועות) זכר או נקבה C57BL/6.

2. משטרי טיפול

1. משטר טיפול לבחינת תרומתם של תאי nTreg לדומיננטיות החיסונית של_{T CD8}
   1. ארבעה ימים לפני ההכנה in vivo של עכברי C57BL/6 עם תאי C57SV (שלב 1.10), הזריקו לכל חיה פעם i.p. 0.5 מ"ג של נוגדן חד-שבטי (mAb) דל אנדוטוקסין, נטול אזיד, שאינו מכלה תאי nTreg, או עם בקרת איזוטיפ IgG1 של חולדה (למשל, שיבוט KLH/G1-2-2, HRPN משובט או שיבוט TNP6A7).
2. משטר טיפול לבדיקת המשמעות In Vivo של חלבוני מוות תאי מתוכנתים (PD-1-PD-L1(2)) אינטראקציות בעיצוב T_CD8 Immunodominance
   הערה: המעורבות של PD-1 על ידי PD-L1 לעתים קרובות, אך לא תמיד, מתווכת את העיכוב המשותף ו / או התשישות של T_CD8 ספציפי ל- Ag. לכן, טיפול באנטי-PD-1 יכול להתבצע במקביל למתן אנטי-PD-L1 ואנטי-PD-L2 mAbs כדי לחשוף את האינטראקציה הבין-תאית המדויקת המעורבת בתופעה ביולוגית.

3. הכנת טחול מטרה

1. המתת חסד של עכברי C57BL/6 נאיביים תואמי מין (בני 6-12 שבועות) שישמשו כתורמי טחול על ידי פריקת צוואר הרחם.
2. מקמו כל עכבר כשהבטן שלו פונה כלפי מעלה בתוך ארון בטיחות ביולוגי. רססו את העור באתנול 70% (v/v), EtOH. בעזרת מלקחיים סטריליים ומספריים, מרימים את העור ומבצעים חתך קטן בקו האמצע הגחוני. לאחר מכן, לחתוך את העור בצורה צלב כדי לחשוף את הצפק.
3. באמצעות מלקחיים, למשוך את הצפק בצורה דמוית אוהל מבלי לחטוף אף אחד מהאיברים הפנימיים. חותכים את הצפק פתוח כדי לחשוף את חלל הצפק בעדינות להסיר את הטחול.
4. הניחו את הטחול (ים) בתוך מטחנת רקמות Dounce 15 מ"ל המכילה 5 מ"ל PBS סטרילי. הפעילו לחץ ידני באמצעות בוכנה מזכוכית של המטחנה עד שרקמת הטבור תתפזר לתרחיף תאים הומוגני אדום.
   הערה: בהתאם למספר בעלי החיים המקבלים בכל קבוצת ניסוי, ייתכן שיהיה צורך במספר טחול עכבר תורם להכנת תאי מטרה. ניתן ליצור הומוגניות של עד 3 טחול יחד בתוך מטחנה של 15 מ"ל.
5. מעבירים את ההומוגנט לצינור של 15 מ"ל. סובב את הצינור ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
6. השליכו את הסופרנטנט. להשהות תאים כדוריים ב 4 מ"ל של אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) חיץ שוכב במשך 4 דקות כדי לחסל אריתרוציטים.
   הערה: זהו שלב תלוי זמן. חשיפת יתר של הטחול לחיץ ACK תגביר את שבריריותם ותהפוך אותם לרגישים למוות תאי לא ספציפי.
7. לכל צינור, הוסף 8 מ"ל של Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) בינוני המכיל 10% FBS מומת חום, L-alanyl-L-גלוטמין, 0.1 mM לפחות מדיה חיונית (MEM) חומצות אמינו לא חיוניות, 1 mM נתרן פירובט, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), ו 1x פניצילין/סטרפטומיצין, אשר ייקרא להלן מדיום RPMI מלא (טבלה של חומרים).
8. העבר את התוכן דרך נקבוביות 70 מיקרומטר של מסננת תאים לתוך צינור חדש של 15 מ"ל.
9. סובב את הצינור ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
10. השליכו את הסופרנטנט. להשהות תאים כדוריים ב 12 מ"ל של RPMI מלא.
11. לפצל את תרחיף הטחול ל -3 חלקים שווים (4 מ"ל כל אחד) ב -3 צינורות נפרדים.

4. ציפוי טחול מטרה בפפטידים לא רלוונטיים וקוגנטיים

1. תייגו את הצינורות בהתאם לפפטידים שישמשו לפעימות הטחול המטרה. טחול הבקרה יפועם בפפטיד לא רלוונטי, וכל אוכלוסייה של טחול מטרה קוגניטיבי תהיה פועמת עם פפטיד סינתטי המתאים לאפיטופ האימונודומיננטי הנגזר מ-T Ag (אתר IV) או אפיטופ T Ag תת-דומיננטי (אתר I או אתר II/III) (טבלה 1).
   הערה: בחירת הפפטידים הלא רלוונטיים תלויה במערך הניסוי ובזן העכבר המשמש בכל חקירה. המחברים משתמשים לעתים קרובות ב-gB_498-505 (אפיטופ פפטיד אימונודומיננטי מוגבל^{H-2K b} של נגיף הרפס סימפלקס [HSV]-1) ו/או GP_33-41 (אפיטופ פפטיד אימונודומיננטי מוגבל^{H-2D b} של נגיף כוריאומנינגיטיס לימפוציטית ([LCMV]) בעכברי C57BL/6 (טבלה 1). פפטידים אלה הם בחירה אופטימלית כי: (i) הם נגזרים מפתוגנים שלא נתקלו בהם קודם לכן במודל העכבר המתואר כאן; (ii) בדומה לפפטידים שמקורם ב-T Ag, gB_{498-505 ו-GP 33-41} מוגבלים על^{ידי מולקולות} H-2b ונקשרים אליהן. במבחני הריגת "שלושה שיאים" in vivo, כל אחת משתי הפסגות התואמות לתאי מטרה קוגניטיביים עשויה לייצג טחול הפועם בפפטיד אימונודומיננטי או תת-דומיננטי. הבחירה של כל קבוצת פפטידים משתנה בהתאם למטרות של כל ניסוי. ראו איור 1 ואיור 2 כדוגמאות לשונות כזו. עבור שאר פרוטוקול זה, אתרים שמקורם ב-T Ag I ו-IV ייצגו פפטידים תת-דומיננטיים ואימונו-דומיננטיים, בהתאמה.
2. יש לפעום את התוכן של כל צינור מסומן עם 1 מיקרומטר של הפפטיד המתאים למשך שעה אחת ב-37°C ו-5% CO₂.
3. השתמש במסננת תאים נפרדת (עם נקבוביות של 70 מיקרומטר) עבור כל צינור כדי להסיר גושים ולכלוך במידת הצורך.
4. סובב את הצינור ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
5. להשהות מחדש תאים כדוריים ב 12 מ"ל של PBS קר סטרילי ולחזור על שלב 4.4 פעם נוספת.
   הערה: חשוב להסיר כמה שיותר FBS מכיוון ש- FBS יכול לקשור carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE) בשלב הבא.

5. סימון טחול מטרה עם CFSE

1. להשהות מחדש טחול פפטיד פולסים ב 4 מ"ל של PBS סטרילי.
2. הוסף CFSE ב- 0.025 μM, 0.25 μM ו- 2 μM לצינורות המכילים פפטיד לא רלוונטי, אתר I-, וטחול פועם IV, בהתאמה.
   הערה: כדי להשיג תיוג CFSE אחיד, החזק כל צינור בזווית של 45° לפני הוספת CFSE לצד מעט מעל מתלה התא ולאחר מכן מערבולות עדינות. זה יבטיח את המראה של היסטוגרמות חלקות בסוף. וריאציות תלויות אצווה וגיל בעוצמות CFSE אינן נדירות. לכן, ייתכן שיהיה צורך להתנסות עם מינונים CFSE דיפרנציאלי לפני שתחליט על הריכוזים האופטימליים לשימוש.
   זהירות: CFSE רעיל בריכוזים גבוהים מ-5 מיקרומטר.
3. מניחים את הצינורות בתוך אינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות והופכים אותם אחת ל-5 דקות.
4. הוסף 3 מ"ל של FBS מומת חום לכל צינור כדי לעצור את תגובת CFSE. טען את התוכן עם PBS סטרילי.
5. סובב את הצינור ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
6. להשהות מחדש תאים כדוריים ב 12 מ"ל של PBS סטרילי ולחזור על שלב 5.5.

6. בחינת תיוג CFSE הולם/שווה של אוכלוסיות טחול מטרה

1. Resuspend תאים כדוריים ב 3 מ"ל של PBS.
2. מערבלים את הצינורות בעדינות. העבר 10 μL, כל אחד, של CFSE^נמוך,^{CFSE ביניים (int)} ותרחיפים^{של תאים גבוהים} CFSE לתוך צינור מיון תאים מופעל פלואורסצנטיות (FACS) של 5 מ"ל בתחתית עגולה המכיל 200 מיקרוליטר של PBS.
3. לחקור תאים באמצעות ציטומטר זרימה מצויד לייזר 488 ננומטר. צייר שער לימפוציטים בהתבסס על תכונות פיזור קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC) של התאים לפני רכישת 5000 אירועים הנופלים בתוך שער הלימפוציטים בערוץ FL-1.
4. בתוך אוכלוסיית CFSE⁺ 'האב', צייר שערי היסטוגרמה נוספים כדי לזהות תת-אוכלוסיות CFSE^נמוך, CFSE^int ו^- CFSE גבוה.
5. אשר מספרי אירועים שווים או כמעט שווים בתוך שלושת השערים. במידת הצורך, התאם את מספרי התאים בצינורות 'המקור' (שלב 6.1) לפני ערבוב והזרקת טחול המטרה לעכברים תמימים ודרוכים בסעיף 7.

7. הזרקת תאי מטרה עם תווית CFSE למושתלים נאיביים ו-T-Ag-primed

1. מערבלים בעדינות את צינורות המקור. העבר את שלושת מתלי התאים המסומנים ב- CFSE ביחסים שווים לתוך צינור חדש.
2. טען את התוכן עם PBS סטרילי.
3. סובב את הצינור ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשהות תאים כדוריים עם PBS סטרילי.
4. ספרו תאים בכחול טריפאן על ידי המוציטומטר כדי להבטיח כדאיות תאית של לפחות 95%.
5. כוונן את עוצמת הקול על מנת להזריק 1 x 10⁷ תאי מטרה מעורבים/200 μL PBS תוך ורידי (i.v.), דרך וריד הזנב, לכל מושתל C57BL/6 mouse.
   הערה: אחסנו את התאים על קרח בין הזרקות. ערבבו בעדינות את תאי המטרה לפני כל הזרקה. רשום את זמן ההזרקה המדויק עבור כל עכבר, אשר יקבע מתי יהיה צורך להרדים את החיה. חשוב לשמור על משך ציטוטוקסיות in vivo עקבי בין כל בעלי החיים באותו ניסוי.

8. איסוף נתונים

1. שעתיים או ארבע שעות לאחר הזרקת תאי המטרה המסומנים ב-CFSE, יש להרדים את העכברים המקבלים על ידי נקע צוואר הרחם.
   הערה: משך הזמן של ציטוטוקסיות in vivo יכול להשתנות בהתאם למערכת הניסוי המופעלת, האימונוגניות של המטרה Ags, השפע הצפוי של T_CD8 ספציפי לאנטיגן פפטידי בטחול, ואת החוסן של הפונקציה הליטית שלהם בין גורמים אחרים.
2. הסר ועבד כל טחול בנפרד כמו בשלבים 3.2-3.9.
3. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים הכדוריים ב-3 מ"ל של PBS.
   הערה: יש לנקוט משנה זהירות בטיפול ברקמת הטחול ובהכנת התאים בטמפרטורה של 4°C או על קרח לפני ניתוחים ציטופופלואורימטריים. זאת על מנת למנוע המשך ציטוטוקסיות ex vivo.
4. להעביר כ 1x10⁷ תאים מכל טחול מעובד לתוך צינור FACS נקי.
5. חקור תאים באופן מיידי באמצעות ציטומטר זרימה המצויד בלייזר 488 ננומטר. צייר שער לימפוציטים בהתבסס על תכונות FSC ו- SSC של התאים.
6. זהה את הטחול של הנמען ^CFSE ואת תאי היעד המועברים על ידי CFSE⁺. צייר שערים נוספים המתאימים לאוכלוסיות תאי יעד^{מובהקות} של CFSE^נמוך, CFSE^int ו- CFSE גבוה.
7. לרכוש סך של 2000 CFSE^{אירועים נמוכים} בערוץ FL-1.

9. ניתוח נתונים

1. חשב את הליזה הספציפית של כל אוכלוסיית תאי יעד קוגניטיבית באמצעות הנוסחה הבאה:
   % ציטוטוקסיות ספציפית =
   כאשר x = CFSE^{int/מספר אירוע גבוה} בעכבר T Ag-primed, y = מספר אירוע^נמוך של CFSE בעכבר T Ag-primed, a = מספר אירוע^int/high של CFSE בעכבר נאיבי, ו- b = מספר אירוע^נמוך של CFSE בעכבר נאיבי.
   הערה: במבחני ציטוטוקסיות "תלת-שיאיים" שבהם מוערכת הליזה הספציפית של יותר מאוכלוסיית יעד קוגניטיבית אחת, אין זה ראוי להשתמש בתדרי תאי המטרה. הסיבה לכך היא פשוט שהתדירות של אוכלוסיית תאי מטרה קוגניטיביים מושפעת לא רק מאחוז הבקרות הלא רלוונטיות, אלא גם מזה של טחול המטרה הקוגניטיבי האחר. לכן, יש להשתמש במספרי אירועים בתוך כל שער בנוסחה לעיל כדי לחשב במדויק את הליזה של כל אוכלוסיית תאי יעד קוגניטיבית (CFSE^int או CFSE^{תאים גבוהים}) כנגד בקרות^נמוכות של CFSE.

טבלה 1. פפטידים שהוכנסו בפרוטוקול זה.

מקור אנטיגן חלבוני	פפטיד אפיטופ	ייעוד	רצף	הגבלת MHC I
SV401 T Ag גדול2	טאג 206-215	אתר א'	SAINNYAQKL	H-2Dב
SV40 T Ag גדול	ט אג223-231	אתר II/III	CKGVNKEYL	H-2Dב
SV40 T Ag גדול	ט אג404-411	אתר IV	VVYDFLKC	H-2Kב
SV40 T Ag גדול	ט אג489-497	אתר V	QGINNLDNL	H-2Dב
HSV-13 גליקופרוטאין B	gB498-505*	gB498-505	SSIEFARL	H-2Kב
LCMV4 גליקופרוטאין	GP33-41*	GP33-41	KAVYNFATC	H-2Dב
1וירוס סימיאן 40
2אנטיגן גידול גדול
3הרפס סימפלקס וירוס סוג 1
4וירוס כוריאומנינגיטיס לימפוציטי
*משמש כפפטיד לא רלוונטי

תוצאות

איור 1: ניתוח ציטופלואורימטרי מייצג של ציטוטוקסיות בתיווך_{T CD8} כנגד אפיטופים שמקורם ב-T Ag בנוכחות או היעדר תאי nTreg. טחול המטרה פועם בפפטידי בקרה, אתר I או אתר IV, אשר סומנו באופן דיפרנציאלי עם CFSE, היו במעקב על ידי ציטומטריית זרימה בטחול של עכבר נאיבי (פאנל שמאלי), עכבר T Ag-primed מוזרק PBS (פאנל אמצעי), ועכבר T Ag-primed מוזרק PC61 (nti-CD25) (nTreg-depleted) T Ag-primed עכבר (פאנל י...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.25% טריפסין-EDTA (1X)	תרמו פישר סיינטיפיק	25200-056
ACK Lysing Buffer	תרמו פישר סיינטיפיק	A1049201
CD25 נגד עכבר (שיבוט PC-61.5.3)	תא Bio X	BE0012
PD-1 נגד עכבר (שכפול RMP1-14)	תא Bio X	BE0146
CFSE	תרמו פישר סיינטיפיק	C34554
DMEM (1X)	תרמו פישר סיינטיפיק	11965-092
סרום בקר עוברי (FBS)	Wisent Bioproducts	080-150	השבתת חום לפני השימוש
GlutaMAX (פי 100)	תרמו פישר סיינטיפיק	35050-061
HEPES (1M)	תרמו פישר סיינטיפיק	15630080	ריכוז סופי של 10 מ"מ
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM (100X)	תרמו פישר סיינטיפיק	11140-050
פניצילין/סטרפטומיצין	סיגמא-אולדריץ'	P0781	המלאי הוא פי 100
חולדה IgG1 (שיבוט KLH/G1-2-2)	סאות'רן ביוטק	0116-01	בקרת איזוטיפ
חולדה IgG1 (שיבוט HRPN)	תא Bio X	BE0088	בקרת איזוטיפ
חולדה IgG1 (שיבוט TNP6A7)	תא Bio X	BP0290	בקרת איזוטיפ
חולדה IgG2a (שיבוט 2A3)	תא Bio X	BP0089	בקרת איזוטיפ
RPMI 1640 (1X)	תרמו פישר סיינטיפיק	11875-093
נתרן פירובט (100 mM)	תרמו פישר סיינטיפיק	11360-070	1 מ"מ ריכוז סופי