הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF של היווצרות וסגירת פגוזום

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

הערה: הפלסמיד המשמש את Lifeact-mCherry הוא מתנה חביבה של ד"ר גיום מונטניאק, מכון קירי, פריז.

1. תאים וטרנספקציה

הערה: מקרופאגים RAW264.7 גדלים לתת-מפגש בתווך מלא (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 בינוני, 10 mM HEPES, 1 mM נתרן פירובט, 50 מיקרומטר β-מרקפטואתנול, 2 mM L-גלוטמין ו-10% FCS (סרום עגל עובר)) בצלחת של 100 מ"מ. הם נגועים פלסמידים המקודדים חלבונים מתויגים פלואורסצנטית על ידי אלקטרופורציה. באופן שגרתי כ 5 - 6 x 10^{6 תאים} נגועים עם 20 מיקרוגרם או 10 מיקרוגרם של פלסמיד עבור כל transfection או co-transfection בהתאמה. שים לב כי אמצעים אחרים של transfection המבוססים על electroporation או lipofection יכולים לשמש כגישות חלופיות.

1. לגרד את התאים עם מרים תאים ולהשהות אותם מחדש ב 10 מ"ל של מדיום תרבית על ידי pipeting למעלה ולמטה מספר פעמים.
2. צנטריפוגה את מתלה התא 300 x גרם, 5 דקות ב- RT ברוטור זווית מתנדנדת.
3. מחממים מראש 10 מ"ל של מדיום מלא בתוספת 10 מיקרוגרם / מ"ל של גנטמיצין ב 37 ° C.
4. לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-3 מ"ל של "חיץ כביסה A" מערכת האלקטרופורציה.
5. צנטריפוגה את מתלה התא 300 x גרם, 5 דקות בטמפרטורת החדר ברוטור זווית מתנדנדת.
6. בינתיים מכינים את תערובת הדנ"א בטמפרטורת החדר: 120 μl 2x Buffer B, 20 מיקרוגרם של פלסמיד DNA מקודד לחלבון המעניין, q.s.p. 240 μl H₂O.
7. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את כל הסופר-נטנט.
8. משעים מחדש את גלולת התא בתערובת הדנ"א ומעבירים לקוביות אלקטרופורציה בקוטר 4 מ"מ.
9. יש לדגור ב-RT במשך 3 דקות.
10. אלקטרופורטאט ב 250 V, 900 μF.
11. מיד להשעות מחדש את התאים בתווך שחומם מראש (37 ° C) שלם בתוספת gentamicin צלחת אותם צלחת 100 מ"מ.
12. לדגור על התאים הנגועים לילה ב 37 ° C, 5% CO₂.
13. למחרת בבוקר, להחליף את המדיום המלא עם 10 מ"ל של מדיום מיקרוסקופיה ללא סרום (RPMI 1640 ללא פנול אדום, 10 mM HEPES, 1 mM נתרן פירובט, 50 μM β-mercaptoethanol, 2 mM L-גלוטמין).

2. אופסוניזציה של תאי דם אדומים

הערה: כמודל של יעד חלקיקים עבור מקרופאגים, תאי דם אדומים של כבשים (SRBCs) משמשים. בדרך כלל, סביב 7 x 10⁶ SRBCs לכל צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ משמש.

1. שטפו את ה-SRBCs עם 100 μl של 1x PBS (מלח חוצץ פוספט) / 0.1% BSA (אלבומין בסרום בקר) וצנטריפוגה (600 x גרם, 4 דקות).
2. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את ה-SRBCs ב-100 מיקרוליטר של 1x PBS/0.1% BSA וצנטריפוגה (600 x גרם, 4 דקות).
3. לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את ה-SRBCs ב-1x PBS/0.1% BSA עם ארנב IgG anti-SRBCs בריכוז תת-אגלוטיני. השתמש 500 μl של תמיסה המכילה נוגדן/5 μl של SRBCs.
   הערה: הריכוז התת-אגלוטיני של נוגדנים מתאים לריכוז הנמוך ביותר שלא גרם לאגלוטינציה שזוהתה כהיווצרות רשת. באופן כללי, הריכוז sub-agglutinating הוא 8.2 מיקרוגרם / מ"ל.
   1. לקבוע את הריכוז של IgG anti-SRBCs הדרושים כדי opsonize SRBCs על ידי בדיקת hemagglutination. לדלל באופן סדרתי את IgG anti-SRBCs (מלאי ב 13.1 מ"ג / מ"ל) בין 1/50 - 1/25,600 במיקרו. הוסף 2 x 10⁶ SRBCs בכל באר. לדגור על הצלחת בחושך ב RT במשך כמה שעות.
4. יש לדגור ב-RT במשך 30 דקות עם סיבוב איטי.
5. לאחר שתי שטיפות ב-1x PBS/0.1% BSA כמתואר לעיל, יש להשהות מחדש את ה-SRBCs מסוג IgG-opsonized (IgG-SRBCs) באמצעי מיקרוסקופיה מחומם מראש ללא סרום (2 מ"ל/מנה).

3. ציפוי פולי-ליזין של Coverslips

1. בינתיים, טפלו בכלי זכוכית תחתונים בקוטר 35 מ"מ עם 2 מ"ל של 0.01% פולי-ל-ליזין למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
2. לשטוף את הכלים פעמיים עם 2 מ"ל של 1x PBS.

4. קיבוע לא קוולנטי של SRBCs על צלחות זכוכית תחתונה

1. יוצקים 2 מ"ל של תרחיף SRBCs לכל צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ.
2. צנטריפוגה עם רוטור מתנדנד ב 500 x גרם במשך 2 דקות על כלים תחתונים זכוכית 35 מ"מ.
3. יש להסיר את הסופרנאטנט ולשטוף פעם אחת עם 2 מ"ל של 1x PBS/10% BSA.
4. דגרו על החלקיקים במשך 30 דקות עם 2 מ"ל של 1x PBS / 10% BSA לכל מנה.
5. לשטוף את הכלים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS.
6. יש להחליף PBS אחד ב-2 מ"ל של מדיום מיקרוסקופיה ללא סרום שחומם מראש (37°C).

5. פגוציטוזה המומחשת על ידי TIRFM

1. מיקרוסקופ
   הערה: TIRFM בוצע באמצעות מיקרוסקופ המצויד במטרה לטבול שמן (N 100X, NA1.49), תא חימום עם CO₂, ושתי מצלמות זיהוי פוטון בודדות EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) יחד עם עדשת 1.5X.
   1. יום לפני מפגש המיקרוסקופ TIRF, הפעל את תא החימום ב 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר חימום הומוגני של שלב המיקרוסקופ.
2. קביעת זווית קריטית
   הערה: תוכנת ImageJ Color Profiler משמשת לעיבוד זרמי תמונה TIRF.
   1. הניחו מתחת למיקרוסקופ צלחת תחתית מזכוכית בקוטר 35 מ"מ המכילה SRBC שעבר אופסונציה עם אמצעי מיקרוסקופיה ללא סרום.
   2. לגרד את התאים ולהשעות אותם מחדש במדיום לפני הוספתם (100 - 500 μl) בצלחת.
   3. השתמש בתוכנת "רכישה חיה" כדי לשלוט במיקרוסקופ ולבצע עירור עם לייזר 491 ננומטר ו / או 561 ננומטר כדי לזהות תאים המבטאים חלבונים מתויגים פלואורסצנטית.
   4. זהה תא המבטא את החלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי.
   5. מקמו אותו במרכז השדה וקבלו 500 תמונות באורך גל עירור אחד, עם זוויות שונות החל מ-0º ועד 5º, עם הפרש קבוע של 0.01º (איור 1A). הזוויות משתנות אוטומטית על ידי מערכת המיקרוסקופ.
   6. לקבוע את הזווית הקריטית המאפשרת לאור האירוע להיות מוחזר לחלוטין בממשק זכוכית/מדיום וליצור את הגל האוונסנטי. באמצעות תוכנת ImageJ Color Profiler, פתח את רצף התמונות על ידי לחיצה על "קובץ", "פתח" ובחר את הקובץ.
   7. בחר אזור עניין (ROI), בעזרת הכלי המלבני, בתא עם פלואורסצנטיות אחידה (איור 1B צהוב 1).
   8. התווה את "פרופיל ציר Z" פירושו עוצמת פלואורסצנטיות שנמדדה בהחזר ההשקעה עם פונקציה של הזוויות על ציר x על ידי לחיצה על הכרטיסייה "תמונה", "ערימות" בתפריט הנפתח ו"התווה פרופיל ציר Z" (איור 1B אדום 2).
      הערה: הזווית הקריטית היא הזווית המובילה לפלואורסצנטיות המקסימלית לפני ירידה חדה בפלואורסצנטיות.
   9. השתמשו בכל ערך של זווית על ציר x העולה על הזווית הקריטית במהלך הפעלת המיקרוסקופ כדי לקבל אות TIRF כדוגמה 2.00 (איור 1C).
3. רכישות
   1. באמצעות תוכנת Live Acquisition, הגדר את פרמטרי הרכישה באמצעות המודול "עורך פרוטוקולים" (איור 2A).
      1. צור פרוטוקול עם "לולאה" הכוללת רכישת "רב ערוצים" כדי לרכוש אות פלואורסצנטי מחלבונים בעלי עניין באזור TIRF. הזן את זווית TIRF (לדוגמה 2.00), את זמן החשיפה (לדוגמה 50 מילישנייה) ואת עוצמת הלייזר (לדוגמה 50%) (איור 2B 1).
      2. הצג "מהלך Z" של המטרה 3 מיקרומטר מעל אזור TIRF כדי להשיג רכישת אות באפיפלואורסנציה עם הכלי "Multi Channels". הזינו זווית מתחת לזווית הקריטית (לדוגמה 1.00), זמן האקספוזיציה (50 מילישנייה) ועוצמת הלייזר (50%) (איור 2B, 2 ו-3).
      3. לאחר מכן הוסף "מהלך z" של המטרה 3 מיקרומטר למטה, כדי לחזור באזור TIRF (איור 3B 4). הוסף "תצלום בזק" של התא בנורית LED בהירה (דיודה פולטת אור) (איור 2B 5).
   2. מצא תא מעניין עם רמה מתונה של ביטוי חלבון מתויג פלואורסצנטית היוזם phagocytosis של SRBC על ידי הרחבת קרום פלזמה סביב החלקיק.
   3. מניחים אותו במרכז השדה.
   4. התחל להזרים רכישה של 500 - 1,000 פריימים. בכרטיסייה "ספירת לולאה", הזן "750 מסגרות" (איור 2B 1).
      הערה: תוכנת ImageJ Color Profiler משמשת לעיבוד זרמי תמונה TIRF.
   5. פתח את תמונות הרצף בתוכנת Image J על ידי לחיצה על "קובץ", "פתח" ובחירת הקובץ.
   6. הפרד את הערוצים על ידי לחיצה על הכרטיסייה "תמונה ", התפריט הנפתח "Hyperstacks" ועל הפונקציה "Stack to hyperstack". השלם את החלון שהופיע: סדר: xyctz; ערוץ (c): מספר ערוצים (לדוגמה: "2" אם יש לך שני פלואורוכרומים); פרוסות (z): מספר פרוסות בציר z (לדוגמה: "1" אם אין תזוזה בציר z); מסגרות (t): מספר התמונות מחולק למספר ערוצים; מצב תצוגה: Grayscale.
      הערה: נוצרים שני רצפי תמונות נפרדים, המתאימים לשני הערוצים השונים.

איור 1. ייצוג סכמטי של "בדיקת הסגירה הפגוזומית" שנותחה על ידי TIRFM. בדיקת סגירת הפאגוזום מבוצעת באמצעות מקרופאגים המבטאים באופן ארעי חלבון אחד או שניים המתויגים באופן פלואורסצנטי. מקרופאגים מופקדים על SRBCs מסוג IgG-opsonized שאינם קבועים באופן קוולנטי על כיסויים מצופים פולי-ליזין. התמונות מוקלטות במצב TIRF כדי לזהות את האתר של סגירת phagosome ובמצב epifluorescence כדי לזהות את הבסיס של phagocytic.

איור 2: קביעת הזווית הקריטית עבור TIRFM. (A) באמצעות "רכישה חיה", תא המבטא חלבונים מתויגים פלואורסצנטית ממוקם במרכז השדה (אזור 1 באדום). עם האפשרות TIRF Stack, התמונות התקבלו באורך גל עירור אחד, עם זוויות שונות החל מ- 0° עד 5°, עם הפרש קבוע של 0.01° (אזור 2 באדום). (B) רצף התמונות נפתח באמצעות תוכנת ImageJ Color Profiler ועוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של אזור עניין (ROI) משורטטת עם פונקציה של הזוויות על ציר x באמצעות "ערימות" ו"פרופיל ציר PlotZ" (אזור 1 באדום). (C) מיקום x של שיא הפלואורסצנטיות בחלקה מתאים לזווית הקריטית: 1.98° (קו מקווקו שחור). ניתן להשתמש בכל ערך לאחר זווית זו. כדוגמה, 2.00° ניתן לבחור (קו אדום).

איור 3. תהליך זרימת עבודה באמצעות מודול רכישה חיה: "עורך פרוטוקולים". (A) בחלון "עורך פרוטוקולים", נוצר בד ציור של זרימת עבודה. (B) פרוטוקול זה כולל "לולאה" של פעולות שהמיקרוסקופ יחזור עליהן מספר הפעמים שהמשתמש החליט עליהן. לדוגמה: 750 (1). לולאה אחת כללה: רכישת "Multi Channels" עם עירור לייזר של חלבונים פלואורסצנטיים בעלי עניין במצב TIRF. לדוגמה: לייזר 491 ננומטר עוצמה 50% -זווית TIRF 2.00 (2); "Z לזוז" של המטרה 3 מיקרומטר (3); רכישת "רב ערוצים" במצב אפיפלואורסנציה (4); "Z זז" של המטרה חזרה לאזור TIRF (5) ו"תמונת מצב" באור משודר (6).