בדיקת מבחנה להערכת ההשפעה האימונומודולטורית של מונוציטים על התפשטות לויקוציטים

תקציר

מקור: Hsu, P., et al. הערכת התכונות האימונומודולטוריות של תאי גזע מזנכימליים אנושיים (MSCs). J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים בדיקה במבחנה כדי לחקור את ההשפעה האימונומודולטורית של תאי גזע מזנכימליים (MSCs) על התפשטות תאי T משפיעים. הבדיקה כוללת תרבית משותפת של MSCs עם PBMCs כדי לגרום לאוכלוסיית המונוציטים לרכוש פנוטיפ אימונומודולטורי, המוביל להפרשת אינטרלוקין-10 (IL-10). לאחר הדגירה עם תאי T CD4⁺ פעילים, המונוציטים המושרים מדכאים ביעילות את התפשטות תאי T.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. בידוד הדרגתי צפיפות של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי (PBMCs)

1. הוסף 25 מ"ל דם שלם heparinized לתוך צינור 50 מ"ל על ידי פיפטה 25 מ"ל.
   1. תאים מדוללים עם 25 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS).
2. מוסיפים 15 מ"ל של שיפוע צפיפות Ficoll-Paque לצינור חדש של 50 מ"ל, ותוך כדי הטיית הצינור, מוסיפים לאט ובזהירות רבה 25 מ"ל של תרחיף התאים המדולל מעל שיפוע הצפיפות כך שלא יהיה ערבוב של הדם כולו עם שיפוע הצפיפות, כלומר ללא הפרעה בממשק שיפוע צפיפות הדם.
3. צנטריפוגה את המתלים משלב 1.2 ב-400 × גרם למשך 30 עד 40 דקות ברוטור דלי מתנדנד מבוקר טמפרטורה ללא בלימה ב-20°C.
   הערה: שלוש שכבות נפרדות צריכות להיות ברורות לאחר הצנטריפוגה: השכבה העליונה היא פלזמה; השכבה השקופה התחתונה היא שיפוע צפיפות Ficoll-Paque; ושכבה תאית דקה אמצעית שהיא PBMCs.
4. יש לשאוף ולהשליך את השכבה העליונה על ידי יניקה עם פיפטה של פסטר, תוך זהירות שלא להפריע לשכבה הבין-פאזית של תאים חד-גרעיניים (כלומר, לימפוציטים, מונוציטים וטסיות דם).
5. בזהירות לאסוף את שכבת התא המונוגרעיני עם פיפטה 10 מ"ל לצינור צנטריפוגה חדש 50 מ"ל.
6. ממלאים את הצינור ב-20 מ"ל PBS, מערבבים היטב וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות ב-20°C. מסירים את הסופרנאטנט לחלוטין לאחר הצנטריפוגה.
7. להשהות מחדש את גלולת התא ב 20 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 10-15 דקות ב 20 ° C. להסיר את supernatant לחלוטין לאחר צנטריפוגה.
   הערה: צעד זה מסיר את טסיות הדם - שאינן רצויות - בתוך PBMCs; ניתן לחזור על שלב זה כדי להבטיח הסרה מלאה של טסיות הדם.
8. אם אין צורך בבחירה של אוכלוסיות ספציפיות, יש להשהות מחדש את כדורי התא בתווך מלא לויקוציטים (10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 1% L-גלוטמין ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין בתווך RPMI-1640) לתרבית לאחר ביצוע ספירת תאים להשעיית 1 מ"ל מדיום לכל 10⁷ PBMCs לפני שתמשיך לשלב הבא.

2. תיוג מגנטי של אוכלוסיות לויקוציטים

1. צנטריפוגה PBMC מתלה ב 300 × גרם במשך 10 דקות ושאיפה סופרנאטנט לחלוטין.
2. גלולת תא השהיה מחדש ב 80 μl של PBS לכל 10⁷ תאים סה"כ.
3. הוסף 20 μl של חרוזים מגנטיים שצוינו (כלומר, חרוזים מגנטיים CD14 לבידוד מונוציטים, חרוזים מגנטיים CD4 לבידוד לימפוציטים מסוג T) לכל 10⁷ תאים בסך הכל.
4. מערבבים היטב ודגרים במשך 15 דקות ב-2 עד 8 מעלות צלזיוס במקרר.
5. מוסיפים 1-2 מ"ל PBS לכל 10⁷ תאים לשטיפה, וצנטריפוגה ב 300 × גרם למשך 10 דקות.
6. לשאוף supernatant לחלוטין להשהות עד 10⁸ תאים ב 500 μl של PBS.

3. ברירה מגנטית של תת-אוכלוסיות לויקוציטים

הערה: מגוון מפרידי חרוזים מגנטיים ועמודות זמינים לבידוד אוכלוסייה ספציפית של לויקוציטים על ידי סמן פני התא ממספר יצרנים. בידוד יכול להיות על ידי ברירה חיובית על בסיס סמן חיובי אחד או כמה או על ידי ברירה שלילית לאחר דלדול אוכלוסיות לא רצויות. גישה כללית של ביצוע ברירה חיובית באמצעות סמן אחד (כלומר, CD4 עבור לימפוציטים T עוזר, או CD14 עבור מונוציטים) מתוארת להלן.

1. הכינו מפריד מגנטי ראשוני כולל עמוד הפרדה בהתאם להוראות היצרן.
2. יש למרוח צינורית המכילה את הדגימה של PBMCs המסומנים. ספק שתי שפופרות צנטריפוגות של 15 מ"ל לאיסוף שברי התאים המסומנים באופן חיובי וללא תווית, בהתאם להוראות היצרן.
3. ספור את מספר התא והשהה מחדש את הלויקוציטים שנבחרו באופן חיובי (כלומר, לימפוציטים מסוג CD4⁺ T או תאי CD14⁺) בתווך מלא של לויקוציטים, באמצעות 1 מ"ל של מדיום לכל 10⁷ תאים.

4. Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) צביעה של לויקוציטים להערכת התפשטות

הערה: CFSE נמצא בשימוש נרחב בחקירות אימונולוגיות, הן במחקרי in vivo והן במחקרי מבחנה. הפרוטוקול שלנו עבר אופטימיזציה למחקר חוץ גופי של אינטראקציות MSC/PBMC (או לויקוציטים אחרים). בעוד שהצעדים הכלליים הכרוכים בביצוע תיוג CFSE במבחנה דומים, ייתכנו הבדלים במינון ובתזמון הספציפיים של הפרוטוקול. זה יכול להיות בגלל מספר גורמים, כלומר, סוג התא הספציפי בשימוש, מספרי תאים בשימוש - אשר יכול להשפיע על עוצמת האות הפלואורסצנטי CFSE.

1. לדלל את תמיסת מלאי CFSE (10 mM) ב- PBS לריכוז העבודה הרצוי של 10 מיקרומטר (פתרון עבודה CFSE). הכן 10⁷ תאים (כלומר, PBMCs או תאי T) לתיוג באמצעות פתרון העבודה CFSE.
2. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 10 דקות כדי לקבל כדור תא ולשאוף את supernatant.
3. יש להשהות את התאים בעדינות ב-1 מ"ל של תמיסת CFSE שחוממה מראש (37°C) ולדגור על התאים למשך 10 דקות ב-37°C.
4. כדי לשטוף עודפי CFSE, דללו את מתלה התא עם 10x (לפי נפח) של מדיום RPMI מקורר מראש (4°C) המכיל 10% FBS. משקעים את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant. שטפו את כדורית התא באופן זה פעמיים נוספות.
5. כדורו מחדש את התאים על ידי צנטריפוגה וספרו את מספר התא. להשהות 10⁷ תאים (PBMCs או תאי T) ב 1 מ"ל לויקוציטים טריים שחוממו מראש מדיום מלא.

5. בדיקת דיכוי אפקט לויקוציטים אימונומודולטוריים שנבחרו על ידי MSC על תאי Effector CD4 ⁺ T מופעלים עם תווית CFSE

1. זרעים MSCs ב 250,000 תאים ב 3 מ"ל של MSC להשלים בינוני ב 6-באר לוחות (צפיפות MSC: 25,000 תאים / ס"מ²) עבור חיבור O/N באינקובטור 37 ° C, המאפשר לתאי גזע להגיע 80% מפגש. לפחות 3 לוחות 6 בארות נחוצים כדי להבטיח מספיק PBMCs MSC cocultured עבור בחירת תת-אוכלוסייה.
2. שואפים בינוני ומוסיפים PBMCs מופרדים לפי שלב 1 אך בלוחות 6 בארות ב 2.5 x 10⁶ תאים / באר (צפיפות התא: 250,000 לויקוציטים / ס"מ²) עם 3 מ"ל של תווך לויקוציטים שלם. תרבות משותפת במשך 48-72 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
3. אוכלוסייה ספציפית לבחירת חרוזים מגנטיים של לויקוציטים אימונומודולטוריים המושרים על ידי MSC (כלומר, תאי CD14⁺) לפי סעיפים 2-3.
   הערה: צביעת ציטוקינים תוך תאית לניתוח ציטומטרי זרימה יכולה להתבצע בשלב זה כדי להעריך שינויים בפרופיל ביטוי ציטוקינים לויקוציטים, כלומר, ביטוי של אינטרלוקין-10 - כפי שמווסת על ידי MSCs.
4. הוסף תאי T אלוגניים CD4⁺ עם תווית CFSE שנוצרו לפי סעיפים 2-4 בלוחות 24 בארות ב 1 מ"ל של תווך לויקוציטים שלם (צפיפות תאי T: 250,000 תאים / ס"מ²) ללויקוציטים המושרים על ידי MSC שנבחרו בחרוזים ביחסים שונים, כלומר, 1:10, 1:5, 1:2 ו- 1:1 (תא לתא).
5. כדי לעורר תאי T ^CD4+, הוסף מיקרו-כדוריות מצומדות α-CD3/28 כדי לקבל יחס חרוז לתא של 1:1.
6. עבור בקרה שלילית, צלחת 500,000 תאי T CD4⁺ / באר בצלחת 24 בארות (צפיפות תאי T: 250,000 תאים / ס"מ²) עם 1 מ"ל לויקוציטים שלם בינוני בלבד; לבקרה חיובית, בנוסף לציפוי אותו מספר של תאי CD4⁺ T / באר, הוסף מיקרו-כדוריות מצומדות α-CD3/28 כדי לקבל יחס חרוז לתא של 1:1.
7. ביום השלישי של תרבית משותפת, להעריך התפשטות של תאי CD4⁺ T המסומנים CFSE (ממוקם צינורות תחתית עגולה) על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה עם 488 ננומטר עירור מסנני פליטה המתאימים פלואורסצאין.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Ficoll-Paque PLUS	GE שירותי בריאות	71-7167-00 AG	צפיפות גרנדיוטית לבידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs)
ערכת מעקב תאים תוססת CFDA-SE (CFSE)	לייף טכנולוגיות	V12883	תווית סלולרית לזיהוי חלוקת תאים
Dynabeads T-Activator CD3/28	לייף טכנולוגיות	111.32ד	הפעלה של לימפוציטים אנושיים מסוג T, למשל תאי T CD4+, תאי T CD8+ וכו '.
מפריד autoMACS™	Miltenyi ביוטק	מפריד autoMACS™	מפריד תאים על בסיס מגנטי
עמודות autoMACS®	Miltenyi ביוטק	130-021-101	עמודות הפרדה
CD14 microbeads, אנושי	Miltenyi ביוטק	130-050-201	לבחירה חיובית של מונוציטים ומקרופאגים אנושיים CD14+ ממרכזיות
חיידקי CD4, אנושיים	Miltenyi ביוטק	130-045-101	לבחירה חיובית של לימפוציטים מסוג T אנושי CD4+ ממרכזיות
סל"ד 1640 בינוני	לייף טכנולוגיות	11875	מדיום תרבית PBMC/לויקוציטים אנושי
DMEM, גלוקוז נמוך, פירובט	לייף טכנולוגיות	11885	מדיום תרבית תאי גזע מזנכימליים אנושיים (MSC)
ל-גלוטמין	לייף טכנולוגיות	25030-081	תוספת עבור MSC בינוני מלא
פניצילין/סטרפטומיצין	לייף טכנולוגיות	15070-063	תוספת PBMC/לויקוציטים ומדיום MSC מלא
סרום בקר עוברי (FBS)	1) Hyclone, עבור תרבית MSC, 2) Life Technologies, עבור כל התאים האחרים (כלומר PBMCs, אוכלוסיות לויקוציטים ספציפיות)	1) SH30070.03 מ' 2) 10091-148	מגרשי בדיקה מראש לתמיכה בתרבית MSC במבחנה
צלחת תרבית תאים 24 בארות	קורנינג	COR3524	צלחת תרבות משותפת
צינור צנטריפוגה 50 מ"ל	קורנינג	430291	בידוד PBMCs מדם שלם על ידי Ficoll-Paque PLUS
צינור צנטריפוגה 15 מ"ל	קורנינג	430766	אוסף של שברי התאים המסומנים והלא מסומנים
צינורות בעלי תחתית עגולה	BD בז	352008	אוסף תאים לאנליזה ציטומטרית של זרימה

מרכזיות מרכזיות