מחקר זרימה חוץ גופית של השפעת תאי סטרומה על גיוס לויקוציטים

תקציר

מקור: Munir, H. et al., ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על גיוס לויקוציטים מזרימה. J. Vis. Exp.(2015)

הסרטון מדגים שיטה לחקר ההשפעה של תאי סטרומה על גיוס לויקוציטים. במודל מקביל של תא זרימת לוחות, ציטוקינים מעודדי דלקת גורמים לביטוי קולטני הידבקות על ידי תאי אנדותל, מה שמקל על גיוס נויטרופילים ונדידה. ההצלבה בין תאי סטרומה לתאי אנדותל מפחיתה את גיוס הנויטרופילים לתאי האנדותל.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. בידוד ותרבית של תאי אנדותל אנושיים ראשוניים ותאי גזע מזנכימליים

1. בידוד ותרבית של תאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVEC):
   1. שים את חבל הטבור על מגש עם מגבות נייר לרסס אותו עם אתנול 70%. מניחים במכסה מנוע של תרבית רקמה. זהה את הווריד ואת הצינורית בשני הקצוות. הניחו אזיקון סביב הקצה המשומר כדי לאבטח אותו.
   2. לשטוף דם ורידי עם מלוחים חוצצים פוספט (PBS) באמצעות מזרק. ממלאים את המזרק באוויר ועוברים דרך הווריד כדי להסיר ולהשליך את שאריות PBS.
   3. הפשירו 10 מ"ג/מ"ל קולגנאז מסוג Ia ודללו 1:10 ב-PBS (עם סידן ומגנזיום כלורי) לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל. העבירו את תמיסת הקולגנאז לווריד עד למילוי שתי הצינוריות. סגרו את המהדקים על הצינורית בשני קצותיה.
   4. מכסים את המגש בטישו ומרססים באתנול 70%. הכניסו את הכבל לאינקובטור למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% פחמן דו-חמצני (CO₂).
   5. מוציאים את הכבל מהאינקובטור ומהדקים את האזיקונים. עסו את הכבל בעדינות במשך דקה אחת. שטפו את תרחיף התא עם PBS של 10 מ"ל ואספו בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
   6. מלא את המזרק באוויר ועבור דרך הווריד כדי להסיר כל PBS שארית פעמיים, איסוף PBS בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל המשמש בשלב 1.1.5. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   7. לשאוף supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל תא אנדותל מלא (EC) תווך. EC medium מורכב מ-M199 בתוספת 35 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין סולפט, 10 נ"ג/מ"ל גורם גדילה אפידרמיס אנושי, 1 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון, 2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B ו-20% סרום עגל עוברי.
   8. מוסיפים 4 מ"ל של EC בינוני ואת מתלה EC ל 25 ס"מ 2 צלוחיות. שנה את המדיום למחרת ולאחר מכן כל יומיים.
   9. ECs מציגים מורפולוגיה דמוית אבן מרוצפת (איור 1Ai). עבור בדיקות הידבקות, ECs נזרעים בדרך כלל כאשר הם מגיעים 100% מפגש (ראה סעיף 1.4).
2. בידוד תאי גזע מזנכימליים ג'לי של וורטון (WJMSC) מחבל הטבור האנושי:
   1. בודדו את MSC שמקורו בג'לי של וורטון (WJMSC) מחבל טבור טרי או מחבלים שכבר שימשו לבידוד EC. חתכו את חבל הטבור לחתיכות באורך 5 ס"מ. חותכים כל חתיכה לאורך כדי לחשוף את כלי הדם (2 עורקים [לבן, קשיח] ווריד אחד [צהוב, נפוח]).
   2. בעזרת מספריים ומלקחיים סטריליים מוציאים את כלי הדם ומשליכים. חותכים את כל הרקמה לתוך 2 - 3 מ"מ³ חתיכות. בעזרת מלקחיים מניחים 2 - 3 מ"מ³ חתיכות לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
   3. יש להפשיר 100 מ"ג/מ"ל ממלאי קולגן מסוג II ולדלל 1:100 ב-10 מ"ל PBS עד לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל. יש להפשיר 20,000 U/ml היאלורונידאז מלאי ולדלל 1:400 עד לריכוז סופי של 50 U/ml בתמיסת collagenase.
   4. מוסיפים קוקטייל אנזימטי לצינור הצנטריפוגה המכיל את שברי הרקמות. לדגור על שברי הרקמה במשך 5 שעות ב 37 ° C על מסובב איטי.
   5. לדלל את תרחיף התא 1:5 ב- PBS. הכניסו מסנן נקבוביות בגודל 100 מיקרומטר לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 50 מ"ל. שפכו את מתלה התא על מסנן הנקבוביות בגודל 100 מיקרומטר.
      הערה: שברי הרקמה הנותרים יישמרו על המסנן ותאים ייאספו בצינור הצנטריפוגה 50 מ"ל.
   6. מחק את המסנן. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב RT. לשאוף supernatant ולהשהות מחדש גלולת WJMSC ב 12 מ"ל מדיום תרבית WJMSC מלא (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM גלוקוז נמוך, 10% סרום עגל עוברי (FCS) ו 100 U/ml פניצילין + 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין לערב).
   7. זרעו את כל התאים בצלוחית תרבית^{רקמה בגודל 75} ס"מ. שנה את המדיום לאחר 24 שעות עם 12 מ"ל מדיום תרבית WJMSC מלא. החלף בינוני כל 2-3 ימים. תאים צריכים להגיע 70 - 80% מפגש בתוך 2 שבועות. מעבר כאשר WJMSC מגיע למפגש של 70 - 80 אחוז (ראה סעיף 1.4).
3. הרחבת MSC הנגזר ממח עצם (BMMSC):
   1. בודד MSC שמקורו במח עצם אנושי (BMMSC) כפי שתואר קודם לכן. הוסף 10 מ"ל תא גזע מזנכימלי מחומם מראש, MSC growth medium (MSCGM) לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
   2. הפשירו בקבוקון של p2 BMMSC על ידי הנחת אמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 2 דקות. הוסיפו את מתלה BMMSC לצינור הצנטריפוגה המכיל MSCGM. מערבבים היטב על ידי pipetting.
   3. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוף supernatant לחלוטין.
   4. השהה מחדש תאים ב- 1 מ"ל MSCGM וספור את התאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים דיגיטלי כגון צלולומטר.
   5. תאי זרע לתוך 75 ס"מ² צלוחיות תרבית בצפיפות של 5,000 - 6,000 תאים לס"מ² ב 12 מ"ל MSCGM. שנה את המדיום לאחר 24 שעות עם 12 מ"ל MSCGM. להזין תאים עם 12 מ"ל MSCGM כל 2 - 3 ימים.
   6. מעבר כאשר BMMSC מגיע למפגש של 70 - 80% (ראה סעיף 1.4). תאים מציגים מורפולוגיה פיברובלסטית (איור 1Aii).
4. ניתוק של EC ו- MSC:
   1. לשאוף בינוני מ 25 ס"מ² צלוחיות תרבית. יש להוסיף 2 מ"ל של 0.02% חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) למשך כ-2 דקות. יש לשאוף EDTA ולהוסיף 2 מ"ל טריפסין (2.5 מ"ג/מ"ל). צפו מתחת למיקרוסקופ עד שהתאים הופכים עגולים.
   2. הקש על הבקבוק כדי לנתק את התאים. נטרל את הטריפסין על ידי הוספת מדיום תרבית של 8 מ"ל (תלוי בסוג התא; EC medium עבור HUVEC, DMEM LG עבור WJMSC, ו- MSCGM עבור BMMSC) לבקבוק התרבית ולהעביר את המתלה לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
   3. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוף supernatant ולהשהות מחדש את הגלולה כמתואר להלן.
      1. למעבר של MSC, יש להשהות מחדש את הגלולה במדיום תרבית של 3 מ"ל. מוסיפים 11 מ"ל תרבית בינונית לשלוש צלוחיות תרבית נפרדות^בגודל 75 ס"מ. יש להוסיף תרחיף תאים של 1 מ"ל לכל בקבוק תרבית (פיצול 1:3). מעבר WJMSC ו- BMMSC 3 פעמים (עמ '3) לפני השימוש במבחני תרבות משותפת.
      2. לזריעת EC או MSC במבחני הדבקה – ראה סעיפים 2 ו-3.
5. הקפאת MSC:
   1. בקטע 3 נתק MSC כמתואר בסעיף 1.4. לשאוף supernatant ולהשהות מחדש ב 3 מ"ל קר כקרח CryoSFM. פיפטה 1 מ"ל aliquots של תרחיף התא לתוך 1.5 מ"ל cryovials קר כקרח. שים cryovials במיכל הקפאה.
   2. יש לאחסן את המכל בטמפרטורה של -80°C. יש להעביר לחנקן נוזלי. הפשיר בקבוקון של MSC (בצע את השלבים 1.3.1 - 1.3.6). יש להשהות מחדש את MSC בתרבית של 5 מ"ל (לבחור את המדיום המתאים ל-WJMSC או BMMSC) ולזרוע לתוך צלוחיות^{בגודל 25} ס"מ.

2. הקמת תרביות משותפות של תאי גזע אנדותליים-מזנכימליים על מסננים

1. נתק את WJ או BMMSC כמתואר בסעיף 1.4. להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל MSCGM. בצע ספירת תאים באמצעות המוציטומטר או צלולומטר.
2. כוונן את עוצמת הקול כך שהריכוז הסופי יהיה 5 x 10⁵ MSC ב- 500 μl של MSCGM.
3. בעזרת מלקחיים סטריליים יש להפוך את מסנני PET Transwell בגודל 6 בארות, 0.4 מיקרומטר ולהניח בקופסה סטרילית.
4. זרע 5 x 10⁵ MSC על פני השטח החיצוניים של המסננים. יש לדגור על מסננים בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂ למשך שעה אחת.
5. אסוף מדיה מהמשטח החיצוני של המסנן. ספור את מספר MSCs שאינם דבקים בתקשורת. הפכו מחדש את הפילטרים באמצעות מלקחיים סטריליים והניחו אותם בצלחת תואמת בעלת 6 בארות המכילה 3 מ"ל MSCGM.
6. הוסיפו 2 מ"ל MSCGM על המשטח הפנימי של המסנן (איור 1B). מניחים באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO₂ למשך 24 שעות. טריפסינזה של בקבוק EC בגודל 25 ס"מ² (איור 1Ai; כסעיף 1.4).
7. Resuspend EC ב 8 מ"ל MSCGM (1 x 25cm² בקבוק יזרע ארבעה מסננים 6-באר; ~ 5 x 10⁵ EC / מסנן). שאפו בינוני מהחלק העליון והתחתון של המסננים הנקבוביים. הוסיפו 3 מ"ל MSCGM טרי לתא התחתון (מתחת לפילטר). יש להוסיף תרחיף EC בנפח 2 מ"ל למשטח הפנימי של כל מסנן. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
8. יש לשאוף מדיום כדי לשטוף EC שאינו נדבק ולהחליף אותו ב-MSCGM טרי. הגדר מסנני EC חד-תרבותיים מקבילים על-ידי זריעת תאים על פני השטח הפנימיים מבלי לזרוע תחילה MSC. יש לדגור על O/N בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
9. בדוק כי monolayer EC הוא confluent ואין רווחים. לא ניתן להשתמש בחד-שכבות תת-משתפכות לבדיקות הדבקה (איור 1B).
10. הפשיר 1 x 10⁵ U/ml סטוק גורם נמק הגידול אלפא (TNFα) ולדלל 1:1,000 ב MSCGM לריכוז סופי של 100 U/ml (שווה ערך ~ 10 ng / ml). בצע דילול סדרתי על ידי דילול 100 U/ml TNFα על ידי 1:10 ב MSCGM כדי לקבל 10 U/ml. יש לדלל 10 U/ml TNFα ביחס של 1:10 ב-MSCGM לקבלת 1 U/ml.
11. יש לטפל בחדרים העליונים והתחתונים של המסננים עם 1, 10 או 100 U/ml TNFα (שווה ערך ל~10 נ"ג/מ"ל) ב-37°C למשך 4 שעות לפני הבדיקה.

3. בידוד של לויקוציטים

1. קח דם ורידי ממתנדבים בריאים ו aliquot מיד לתוך צינורות EDTA. הפכו את הצינורות בעדינות כדי לערבב.
2. שכבה 2.5 מ"ל Histopaque 1077 על 2.5 מ"ל Histopaque 1119 בצינור 10 מ"ל בעל תחתית עגולה. שכבה 5 מ"ל של דם שלם על שיפוע היסטופק. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 40 דקות ב RT.
3. קציר נויטרופילים פולימורפו-גרעיניים היקפיים (PMN) בממשק של היסטופק 1077 ו-1119 (מעל שכבת אריתרוציטים). מניחים בשפופרת בעלת תחתית עגולה של 10 מ"ל ומאפרים עד 10 מ"ל עם PBSA. הפוך בעדינות את הצינור והצנטריפוגה במהירות של 400 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
4. לדלל 7.5% תמיסת BSA 1:50 ב-100 מ"ל PBS (עם סידן ומגנזיום כלורי) לריכוז סופי של 0.15% (w/v; PBSA). לשאוף supernatant ו resuspend ב 10 מ"ל PBSA. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב RT.
5. Resuspend ב 1 מ"ל PBSA. קח aliquot 20 μl של תרחיף התא ולהוסיף 380 μl PBSA (דילול 1:20). ספירת תאים באמצעות המוציטומטר או צלולומטר. יש לדלל לריכוז הנדרש (1 x 10⁶/ml עבור מסנני Transwell ומיקרו-מגלשה של Ibidi) ב-PBSA. שמור על תרחיף נויטרופילים ב- RT עד הבדיקה.

4. הרכבת מערכת הזרימה

1. הגדר את מערכת הזרימה כפי שמוצג באיור 1C. הפעילו את תנור החימום וכוונו ל-37°C. חברו מזרק בנפח 20 מ"ל (הסירו את הבוכנה) ומזרק בנפח 5 מ"ל לברז תלת-כיווני. חבר את הברז לתא הפרספקס באמצעות סרט מיקרו-נקבוביות.
2. למדוד ולחתוך חתיכה ארוכה של צינור סיליקון 2/4 מ"מ (עבה) כי הוא בערך המרחק בין השסתום לבין הברז 3 כיוונים. חותכים חתיכה באורך 8 - 10 מ"מ של צינור 1/3 מ"מ (דק) ומכניסים אותה לקצה אחד של הצינור העבה. חברו את צד הצינור העבה לברז התלת-כיווני.
3. חבר את קצה הצינור הדק ליציאה של המיקרו-שסתום התלת-כיווני האלקטרוני. זהו "מאגר שטיפה". חותכים חתיכה באורך 6 - 8 מ"מ של צינורות עבים ודקים.
4. הכניסו את הצינור הדק לקצה אחד של הצינור העבה. מחברים את קצה הצינור העבה למזרק בנפח 2 מ"ל (מסירים את הבוכנה).
5. חבר את קצה הצינור הדק של מזרק 2 מ"ל ליציאה על המיקרו-שסתום האלקטרוני כדי ליצור את "מאגר הדגימה". חבר את השסתום לתא זרימת המסנן על ידי מדידה וחיתוך של חתיכה ארוכה של צינור דק שהוא המרחק בין המיקרו-שסתום למרכז שלב המיקרוסקופ.
6. עבור דגם microslide, חבר חתיכת 8 - 10 מ"מ של צינורות עבים לקצה הצינור הדק. הניחו מחבר בצורת L בקצה הצינור העבה. פעולה זו תתחבר למיקרו-שקופית. עבור דגם המסנן, חבר חתיכת 8 - 10 מ"מ של מנומטר קו כחול Portex המחבר את הצינור לקצה הצינור הדק.
7. הניחו את קצה הצינור הדק על המיקרו-שסתום. זוהי התפוקה הנפוצה למאגרי השטיפה והדגימה. מלא מאגרים עם PBSA. צינורות ראשוניים על ידי הזרמת PBSA דרכם כדי להסיר בועות אוויר.
8. חברו את צינור המנומטר למזרק זכוכית בקוטר 29 מ"מ (50 מ"ל). ראש את המזרק על ידי מילוי אותו עם 10 מ"ל PBSA. הפכו את המזרק כך שהקצה המחובר לצינור פונה כלפי מעלה ודחפו החוצה את כל בועות האוויר. מילוי עם 5 מ"ל PBSA.
9. עבור דגם המיקרו-סלייד בלבד, חברו חתיכת צינור עבה בקוטר 10 - 12 מ"מ לקצה צינור המנומטר המוביל למזרק הזכוכית. הניחו מחבר בצורת L על קצה הצינור העבה. הכניסו את מזרק הזכוכית למשאבת מזרק לעירוי/נסיגה.
10. חשב את קצב זרימת המילוי מחדש (Q) הדרוש ליצירת לחץ הגזירה הרצוי בקיר (τ_w בפסקל, Pa) של 0.1 Pa (מסנני Transwell) או 0.05 Pa (מיקרו-שקופיות של Ibidi) באמצעות הנוסחאות הבאות:
    γ_w = (6. Q) / (w.h²)
    τ = n.γ
    כאשר w = רוחב פנימי ו- h = עומק פנימי של ערוץ הזרימה. n = צמיגות התמיסה הזורמת; PBSA הוא n = 0.7 mPa.s. עבור תא הזרימה של מסנן הלוחות המקבילים, הרוחב (w) הוא 4 מ"מ והעומק (h) הוא 0.133 מ"מ. עומק התא יכול להשתנות מעט בשל הבדלים בעובי אטם Parafilm בשימוש. עבור מיקרו-מגלשה של Ibidi, הרוחב הוא 3.8 מ"מ והעומק הוא 0.4 מ"מ.
    הערה: בשל הבדלים בממדים של ערוץ הזרימה ודינמיקת הלכידה אנו משתמשים בלחצי גזירה שונים עבור מודל המיקרו-החלקה בהשוואה למודל המסנן.

5. הגדרת תא זרימה מקבילי המשלב מסננים

1. חתכו חתיכת פרפילם (באותו גודל כמו כיסוי הזכוכית) באמצעות תבנית מתכת. גזור חריץ בגודל 20 x 4 מ"מ בפרפילם (ליצירת ערוץ הזרימה) באמצעות תבנית מתכת. השתמשו באטם כדי לסמן את תעלת הזרימה על מכסה הזכוכית.
2. יישרו את הקצוות של מסנן 6 הבארות על מכסה הזכוכית. ודאו שהמסנן מכסה את סימוני ערוצי הזרימה. גזור בזהירות את המסנן באמצעות אזמל מסוג 10A.
3. כסו בזהירות את המסנן באטם Parafilm, וודאו שחריץ ערוץ הזרימה נמצא במרכז המסנן (איור 1D). השתמש חתיכת רקמה נקייה לדחוף החוצה את כל הבועות.
4. מניחים את הכיסוי בשקע של הצלחת התחתונה של תא זרימת הפרספקס. מקמו את לוחית הפרספקס העליונה מעל החלק העליון של האטם והבריגו את הלוחות יחד (איור 1D).
5. סובב את הברז התלת-כיווני כדי לאפשר למאגר הכביסה (PBSA) לזרום דרך השסתום. חבר את צינורות Manometer ליציאת הכניסה של לוח הפרספקס העליון. הפעל PBSA דרך ערוץ הזרימה כדי לאפשר לבועות לעבור.
6. חבר את צינור Manometer ממשאב המזרק ליציאת היציאה של צלחת הפרספקס. הגדר את משאבת המזרק למילוי מחדש ולחץ על הפעל. נקו כל PBSA שטפטף על הצלחת העליונה של החדר.
7. הניחו את החדר על הבמה של מיקרוסקופ פאזה הפוכה. התאימו את המיקוד כדי להציג באופן חזותי את ה-EC מעל המסננים (איור 1B).

6. זילוח של לויקוציטים מעל תאי אנדותל

1. שים 2 מ"ל של נויטרופילים מטוהרים לתוך מאגר הדגימה ולהשאיר להתחמם במשך 2 דקות. לשטוף את האנדותל עם PBSA במשך 2 דקות.
2. הפעל את המסתם כדי לנקב נויטרופילים מעל אנדותל. העבירו את הבולוס הנויטרופיל למשך 4 דקות. כבו את השסתום ונתלו את PBSA ממאגר השטיפה למשך שארית הניסוי.
3. ודא כי בועות אוויר לא לעבור דרך ערוץ הזרימה בכל נקודה במהלך הבדיקה כמו זה יהיה לשבש את monolayer EC ולגרום ניתוק של נויטרופילים דבק.

7. הקלטת לכידת נויטרופילים והתנהגות

1. תיעוד גיוס נויטרופילים במהלך זרימת נויטרופילים או לאחר זילוח.
2. בצע את כל ההקלטות הדיגיטליות של לפחות 5 - 10 שדות במרכז ערוץ הזרימה. זהה את מרכז הערוץ על-ידי הזזת המטרה לקצה הערוץ ביציאת הכניסה וזיהוי מרכז היציאה.
   1. להקלטה במהלך זרימת נויטרופילים, צלם תמונות של שדה יחיד כל 10 שניות למשך דקה אחת. עבור לאורך הערוץ והקלט שדה אחר במשך דקה אחת. חזור על הפעולה למשך הבולוס.
   2. להקלטה לאחר זילוח, בצע הקלטות של 10 שניות של 5 - 10 שדות במורד מרכז ערוץ הזרימה להערכת התנהגות לויקוציטים (בדרך כלל 2 דקות לאחר סוף בולוס הנויטרופילים). צלם תמונות כל שנייה במרווח של 10 שניות. זה מאפשר מספיק זמן ללכידה מזרימה והתנהגות של נויטרופילים דבקים להיות מנותחים.
   3. הקלט שדה יחיד המכיל לפחות 10 נויטרופילים שעברו טרנסנדציה במשך 5 דקות, וצלם תמונות כל 30 שניות. זה יכול לשמש כדי לחשב את המהירות של תאים נודדים (מעל או מתחת לאנדותל).
   4. הקלט סדרה נוספת של שדות בני 10 שניות (בדרך כלל 9 דקות לאחר הזילוח). זה מאפשר לנויטרופילים זמן לנדוד דרך חד-שכבתית האנדותל.
   5. עצור את משאבת המזרק והסר את הצינור. יש לפרק את תא הזרימה ולשטוף את מאגר הדגימה והצינורית. חזור על הפעולה עבור מסננים/ערוצי microslide הבאים.

8. ניתוח גיוס והתנהגות לויקוציטים

1. ספרו את מספר הנויטרופילים בכל שדה במהלך הקלטות של 10 שניות בנקודת הזמן של 2 דקות. כל התאים חייבים להיות נוכחים בשדה השניה הראשונה כדי להיספר. תאים שנמצאים באופן חלקי בשדה בשני צדדים (לדוגמה, גבול עליון/ימני) של שדה הראייה נכללים בספירות, כל עוד הם נשארים בשדה במשך 10 השניות המלאות.
2. חשב את המספר הממוצע של נויטרופילים דבקים לכל שדה. מדוד את האורך והרוחב של השדה המוקלט. חשב את שטח השדה. חשב כמה שדות יש ב- 1 מ"מ². הכפל את ספירת הנויטרופילים הממוצעת במספר השדות ב- 1 מ"מ².
3. חשב את המספר הכולל של נויטרופילים מחוררים על ידי הכפלת כמות הנויטרופילים המחוררים (למשל, 2 x 10⁶/ml*Q [למשל, 0.0999 מ"ל/דקה עבור תא זרימה מקבילי]) במשך הבולוס (למשל, 4 דקות).
4. חלק את ספירת הנויטרופילים / מ"מ² במספר הכולל של נויטרופילים מחוררים כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים שנצמדו (תאים דבקים / מ"מ² / 10 6 מחוררים).
5. להעריך אם הנויטרופילים הדבקים מתגלגלים, נצמדים היטב או עוברים טרנספורמציה.
   1. נויטרופיל מתגלגל הוא בהיר פאזה וינוע לאט לאורך חד-שכבה אנדותל (1 - 10 מיקרומטר לשנייה).
   2. תאים שנצמדים היטב הם בהירי פאזה וקשורים לפני השטח של EC, או שנשארים נייחים (כלומר, לא זזים במהלך ההקלטה) או שעברו שינוי צורה ונודדים מעל פני השטח של EC (איור 1Ei).
   3. נויטרופיל שעבר טרנסנדציה הוא פאזה חשוכה ומתחת לשכבת EC (איור 1Eii).
6. חשב את אחוז התאים הדבקים שהם מתגלגלים, נייחים ומועברים. לחלופין, התנהגות נויטרופילים יכולה לבוא לידי ביטוי כמספר תאים כולל המציג את ההתנהגויות השונות על ידי יישום אותה נוסחה המשמשת לחישוב היצמדות כוללת (כמתואר בשלבים 8.6 - 8.7).
   1. סמן את הקצה המוביל של נויטרופיל מתגלגל. סמן את הקצה המוביל של אותו תא בסוף הרצף בן 10 השניות. ציירו קו בין 2 הנקודות ומדדו את המרחק שהתא עבר.
   2. חלק ערך זה במשך ההקלטה שבה התא מתגלגל (כלומר, 10 שניות). נסו לבחור נויטרופילים שנמצאים בשדה במשך כל 10 השניות.
7. כדי לחשב את מהירות הנויטרופילים הנודדים על פני השטח (צורת הפאזה השתנתה, בהירה) או מתחת לאנדותל (פאזה כהה), השתמש בהקלטה של 5 דקות.
   1. ציירו קווי מתאר של תאים שנדדו בתחילת הרצף ועקבו אחר תנועותיהם לאורך הרצף. שימו לב למיקומי X ו- Y של הצנטרויד בכל מרווח של דקה עבור כל תא. הפחיתו את הערכים של מיקומי X ו- Y מהתמונה הראשונה של הרצף מהערכים בתמונה השנייה. זה מבוסס על משפט פיתגורס.
   2. הפחיתו את הערכים מהתמונה השניה מהתמונה השלישית. עשו זאת עבור כל התמונות ברצף. ריבוע הערכים X ו- Y וחבר אותם יחד.
   3. שורש ריבועי את הערך המתקבל. חשב את המהירות עבור כל תא על-ידי ממוצע המהירויות המחושבות בכל מרווח זמן של דקה. מסלול 10 העביר נויטרופילים וחשב את המהירות הממוצעת.

תוצאות

איור 1. הקמת תרבית משותפת EC-MSC וניתוח גיוס נויטרופילים באמצעות בדיקת הידבקות מבוססת זרימה. (A) מיקרוגרף של (i) EC ראשוני ו-(ii) מעבר 3 BMMSC שגדל על צלוחיות של תרביות רקמה. (B) מיקרוגרף של EC ו-MSC בתרבית על תוספות מסנן Transwell 6 בארות. (C) דיאגרמה של מערכת הזילוח המשמשת ליצירת זרימה. (ד) ייצוג סכמטי של תא הזרימה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Collagenase סוג Ia	סיגמא	C2674	יש לדלל ב-PBS של 10 מ"ל לקבלת ריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C ב-1 מ"ל aliquots.
PBS של דולבקו	סיגמא	D8662	עם סידן ומגנזיום כלורי. יש לשמור סטרילי ולאחסן בטמפרטורת החדר.
1X M199 בינוני	גיבקו	31150-022	יש לחמם באמבט מים בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש.
גנטמיצין סולפט	סיגמא	G1397	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. יש להוסיף לבקבוק M199 500 מ"ל.
גורם גדילה אפידרמיס אנושי	סיגמא	E9644	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C ב-10μl aliquots.
סרום עגל עובר (FCS)	סיגמא	F9665	FCS חייב להיות נבדק אצווה כדי להבטיח את הצמיחה ואת הכדאיות של EC מבודד. חום מושבת ב 56°C. לאחסן ב 10ml aliquots ב -20°C.
אמפוטריצין ב	גיבקו	15290-026	חזק והופך רעיל תוך שבוע, כך שמדיום HUVEC מלא טרי חייב להיות מורכב מדי שבוע. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C ב-1 מ"ל aliquots.
הידרוקורטיזון	סיגמא	H0135	המלאי הוא באתנול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C ב-10μl aliquots.
קולגנאז סוג II	סיגמא	C6885	יש לדלל את המלאי ב-PBS לריכוז סופי של 100 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C ב-100μl aliquots.
היאלורונידאז	סיגמא	H3631	יש לדלל את המלאי ב-PBS לריכוז סופי של 20,000U/ml. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C ב-100μl aliquots.
מסננת תאים 100μm עבור צינור צנטיפוגה 50ml	ציוד מעבדה מדעית (SLS)	352360	ניתן להשתמש גם במסננות תאים אחרות הזמינות באופן מסחרי (למשל גריינר ביו-אחד).
DMEM גלוקוז נמוך	ביוסרה	LM-D1102/500	יש לחמם באמבט מים בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש.
תערובת פניצילין/סטרפטומיצין	סיגמא	עמ' 4333	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C ב-1 מ"ל aliquots.
בקבוק תרבית רקמה 25 סמ"ר	SLS	353109
בקבוק תרבית רקמה 75 סמ"ר	SLS	353136
מח עצם, בקבוקון תאי גזע מזנכימליים	לונזה	PT-2501	יש לאחסן בחנקן נוזלי עם ההגעה. התאים נמצאים במעבר 2 עם ההגעה אך מסומנים כמעבר 0. יש להוציא למעבר 3 ולאחסן בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר.
מדיום גידול תאי גזע מזנכימלי (MSCGM)	לונזה	PT-3001	יש לחמם באמבט מים בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש. עבור צביעה ירוקה של Cell Tracker השתמש במדיום ללא FCS.
פתרון EDTA (0.02%)	סיגמא	E8008	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. יש לחמם באמבט מים בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש.
תמיסת טריפסין	סיגמא	T4424	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C ב-2 מ"ל aliquots. יש להפשיר בטמפרטורת החדר ולהשתמש מיד.
קריוביאלים	גריינר ביו-וואן	2019-02	יש לשמור על קרח לפני הוספתו לפני הוספת מתלה תאים.
מיכל הקפאה Mr. Frosty	נלג'ין	5100-0001	יש לאחסן בטמפרטורת החדר. בעת הוספת cryovials עם תאים לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות לפני transfrping תאים לחנקן נוזלי.
צבע ירוק למעקב תאים	טכנולוגיות חיים	C2925	יש לאחסן ב-5μl aliquots בטמפרטורה של -20°C. לדלל ב-5 מ"ל MSCGM שחומם מראש (ב-37°C).
תאי ספירת תאים	Nexcelom	SD-100	לחלופין ניתן להשתמש בהמוציטומטר.
מונה תאים T4 אוטומטי של Cellometer	Nexcelom	אוטומטי T4-203-0238
גורם נמק הגידול α (TNFα)	מערכות מו"פ	210-ת"א-100	יש לדלל את המלאי ב-PBS לריכוז סופי של 100,000U/ml. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C ב-10μl aliquots.
מסנני PET Transwell 6-well, 0.4μm	SLS	353090
K2-EDTA בצינורות 10 מ"ל	זארשטדט		יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
היסטופק 1119	סיגמא	11191	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. יש לחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
היסטופק 1077	סיגמא	10771	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. יש לחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
10 מ"ל צינור תחתון עגול	אפלטון וודס	SC211 142 כ
פתרון 7.5% BSA Fraction V	טכנולוגיות חיים	15260-037	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
מזרקי פלסטיפק 20 מ"ל	בז BD	300613
5 מ"ל מזרקי פלסטיפק	בז BD	302187
מזרקי פלסטיפק 2 מ"ל	בז BD	300185
סרט כירורגי היפו-אלרגני 3M 9m x 2.5cm	מיקרו-נקבוביות	1530-1	השתמש כדי לאבטח את ברז המזרק על הקיר של תא הפרספקס.
צינורות גומי סיליקון, קוטר פנימי/חיצוני (ID/OD) של 1/3 מ"מ (צינורות דקים)	פישר סיינטיפיק	FB68854	חותכים צינורות סיליקון לגודל המתאים. כל הצינורות המובילים ישירות למיקרו-שסתום האלקטרוני חייבים להיות דקים.
צינורות גומי סיליקון ID/OD של 2/4 מ"מ (צינורות עבים)	פישר סיינטיפיק	FB68855
צינורות מנומטר Portex Blue Line	סמיתס	200/495/200	צינורות המובילים למשאבת המזרק.
סטופרקוק תלת-כיווני	BOC Ohmeda AB
מזרק זכוכית 50 מ"ל למשאבה	פופר מיקרומייט	550962	יש להכין לפני השימוש על ידי הסרת בועות אוויר.
כיסוי זכוכית	ריימונד כבש		כיסויים בגודל 26x76 מ"מ לפי הזמנה. פריט מספר 2440980.
אטם פרפילם	אמריקן נשיונל קאן קומפני		חתכו חתיכת פרפילם בגודל 26x76 מ"מ באמצעות תבנית אלומיניום וחתכו לתוכה חריץ בגודל 20x4 מ"מ באמצעות אזמל 10a. עובי האטם הוא כ-133μm.
שני לוחות מקבילים פרספקס	המעבדה לטכנולוגיה יישומית ע"ש וולפסון		תא מעוצב במיוחד המורכב מלוחות מקבילים המוחזקים יחד על ידי 8 ברגים. בפלטה התחתונה יש חריץ צפייה חתוך באמצע ושקע רדוד שנטחן כדי לאפשר מקום לכיסוי, למסנן ולאטם. בלוח הפרספקס העליון יש חור כניסה ויציאה הממוקם מעל ערוץ הזרימה.
מיקרו-שסתום אלקטרוני תלת-כיווני עם שטח מת מינימלי	לי מוצרים בע"מ	LFYA1226032H	מחובר אלקטרונית לספק כוח DC של 12 וולט.
משאבת מזרק לעירוי/נסיגה (PHD2000)	מכשיר הרווארד	70-2001	הגדר את הקוטר ל 29 מ"מ ומלא מחדש (זרימה).
מחבר בצורת L	לאבהוט	LE876	כדי להתחבר ליציאות הכניסה והיציאה לערוץ המיקרו-שקופיות של Ibidi.
מצלמת וידאו	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	מחובר למחשב המאפשר הקלטת סרטונים דיגיטליים.
אימג'-פרו פלוס 7.0	קיברנטיקה תקשורתית	41N70000-61592	לניתוח נתונים. תייג ידנית תאים המציגים את ההתנהגויות השונות. עקוב אחר תאים לניתוח מהירויות גלגול ונדידה.

;