$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. השראת הזדקנות על ידי תרופות כימותרפיות בתאי סרטן בתרבית
הערה: יש לבצע את כל שלבי הטיפול בתאים בסעיף זה בארון בטיחות ביולוגית תוך שימוש בשיטות סטריליות. סעיף זה נכתב עבור סוגי תאים עוקבים. ניתן להשתמש בתאי תרחיף עם שינויים מתאימים כאמור.
- לגדל קווי תאים סרטניים בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי של הספק או המעבדה שסיפקה את קווי התאים הספציפיים שבהם נעשה שימוש.
הערה: תאי מעבר נמוך (p < 10) מועדפים בדרך כלל מכיוון שיהיו רמות נמוכות יותר של הזדקנות משוכפלת, כלומר רקע נמוך יותר, בדגימות תאים לא מטופלות.
- יום לפני השראת ההזדקנות על ידי תרופות, יש לקצור תאים עם טריפסין-EDTA 0.25% (או לפי ההמלצה). נטרול טריפסין על ידי הוספת נפח שווה של מדיום תרבית שלם, והעברת תרחיף התא לצינור חרוטי סטרילי.
הערה: שלב זה אינו נחוץ עבור תאים תלויים.
- ספור את התאים בשיטת ההמציטומטר הסטנדרטית ורשום תאים/מ"ל. תאי צלחת ב 1 × 10 3-10 × 103 תאים / ס"מ2 בצלחות תרבית פלסטיק סטנדרטיות 6 בארות.
הערה: צפיפות ציפוי אופטימלית תלויה בקצב התרבות התאים ויש לקבוע אותה על ידי המשתמש. התאים צריכים להיות בשלב הגדילה של לוג במפגש של כ-10%-20% בזמן הטיפול (כלומר, לאחר דגירה של 18-24 שעות לאחר הציפוי). צפיפות ההתחלה (תאים/מ"ל) של תאי השעיה צריכה להיקבע על-ידי המשתמש. לוחות בעלי שש בארות מניבים בדרך כלל מספיק תאים מזדקנים לכל באר עבור דגימת ניתוח ציטומטריית זרימה סטנדרטית אחת. אם מבצעים מיון זרימה, יש להשתמש בשטח פנים גדול בהרבה (למשל, לוחות P150 מרובים) כדי לאפשר שחזור של מספר מספיק של תאים מזדקנים עבור בדיקות במורד הזרם (≥1 × 106).
- לדגור על תאים מצופים למשך הלילה (18-24 שעות) באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ומחבת לחות.
- טפלו בתאים המצופים בתרופות כימותרפיות מעוררות הזדקנות. כלול לפחות בקרה חיובית אחת, למשל, אטופוסיד (ETO) או בלומיצין (BLM). הכינו בארות כפולות לכל תרופה. כלול ערכה אחת שטופלה ברכב בלבד כבקרה.
הערה: עקומת מינון עבור כל סוכן ניסוי צריכה להיבדק על ידי המשתמש כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי להשראת הזדקנות בקווי התאים הנמצאים בשימוש.
- לדגור על תאים במשך 4 ימים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ומחבת לחות כדי לאפשר את תחילת ההזדקנות. יש לבחון מדי יום שינויים צפויים במורפולוגיה באמצעות מיקרוסקופ אור.
הערה: זמני הדגירה בין 3-5 ימים עשויים להיות מקובלים בהתאם לקצב תחילת ההזדקנות. ניתן לשנות מדיה ולמרוח מחדש את הסוכן (או לא), לפי הצורך, כדי לקדם תנאי גדילה בריאים תוך השגת אחוז מקובל של תאים מזדקנים.
- לאחר תחילת ההזדקנות, קצרו את התאים על ידי הוספת טריפסין-EDTA 0.25% למשך 5 דקות ב-37°C. כאשר תאים מנותקים לתרחיף, נטרלו טריפסין עם נפח שווה של מדיום שלם.
הערה: שלב זה אינו נחוץ עבור תאים הגדלים בהשעיה. אם יבוצע צביעת סמן פני השטח, הימנע משימוש בטריפסין-EDTA מכיוון שהוא יכול להרוס באופן זמני אנטיגנים על פני השטח בתאים. במקום זאת, נתקו בעדינות את השכבה החד-שכבתית באמצעות מגרד תאי פלסטיק סטרילי (או מגיב דיסוציאציה חלופי שנועד לשמר אנטיגנים על פני השטח).
- ספרו את התאים בכל דגימה באמצעות המאציטומטר. חשב את התאים/מ"ל עבור כל דגימה.
הערה: ניתן להוסיף כחול טריפאן כדי להעריך את אחוז התאים המתים בשלב זה (כלומר, עקב טיפול תרופתי), אך מוות תאי ייקבע גם באמצעות צבע כדאיות פלואורסצנטי במהלך תהליך העבודה של צביעת DDAOG.
- Aliquot ≥0.5 × 106 תאים לכל דגימה לתוך 1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה.
הערה: מספר התאים בכל דגימה צריך להיות מתוקנן בכל הדגימות.
- צנטריפוגה את הצינורות במשך 5 דקות ב 1,000 × גרם במיקרוצנטריפוגה ב 4 ° C. להסיר את supernatant.
הערה: אם מיקרו-צנטריפוגה בקירור אינה זמינה, ייתכן שיהיה מקובל לבצע צנטריפוגות בטמפרטורת הסביבה עבור סוגי תאים עמידים מסוימים.
- המשך לצביעת DDAOG בסעיף 2.
2. צביעת DDAOG של SA-β-Gal בדגימות תאים
- לדלל 1 mM Bafilomycin A1 מלאי ב 1:1,000x לתוך מדיום DMEM (ללא FBS) עבור ריכוז סופי של 1 μM.
- הוסף תמיסת Baf-DMEM מוכנה לדגימות כדורי התא (משלב 1.11) לריכוז של 1 × 106 תאים/מ"ל
הערה: לדוגמה, אם אתה משתמש ב- 0.5 ×10 6 תאים לדגימה, הוסף 0.5 מ"ל של Baf-DMEM.
- יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C (ללא CO2) על מסובב/שייקר במהירות איטית.
הערה: הימנעו מאינקובטורים של CO2 לתהליך הצביעה, אשר יכולים להחמיץ תמיסות ובכך להפריע לצביעת Baf ו- DDAOG.
- ללא שטיפה, הוסף את תמיסת מלאי DDAOG (5 מ"ג/מ"ל) ב-1:500x (10 מיקרוגרם/מ"ל סופי) לכל דגימה. פיפטה לערבב. יש להחליף במסובב/שייקר בטמפרטורה של 37°C (ללא CO2) למשך 60 דקות. יש להגן מפני אור ישיר.
- צנטריפוגה את הצינורות למשך 5 דקות ב 1,000 x גרם ב 4 ° C. להסיר את supernatant.
- יש לשטוף עם 1 מ"ל של 0.5% BSA קר כקרח לכל צינור ופיפטה לערבוב. צנטריפוגו את הצינורות למשך 5 דקות ב-1,000 x גרם ב-4°C והוציאו את הסופרנטנט. חזור על שלב זה 2x כדי לשטוף היטב את התאים. הסר את supernatant והמשך.
הערה: חשוב לבצע את שלבי השטיפה בשלב 2.6 כדי להסיר DDAOG לא רצוי, אשר יכול להציג פליטת פלואורסצנטיות לא רצויה (460/610 ננומטר).
- (אופציונלי) קיבוע ואחסון של תאים מוכתמים ב-DDAOG לצורך ניתוח מאוחר יותר
- יש להוסיף 0.5 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד קר כקרח טיפה לכל דגימה שטופה. פיפטה לערבב.
- יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את התאים 2x עם 1 מ"ל של PBS.
- אחסן את הדגימות עד שבוע ב 4 °C לפני ניתוח cytometry זרימה.
הערה: עבור דוגמאות קבועות, דלג על שלב 2.8.
- לדלל Calcein Violet 450 AM מניית (1 mM) ב 1:1,000x לתוך 1% BSA-PBS (1 מיקרומטר סופי). הוסף 300 μL (עבור דגימות תאים בתרבית) לכדורי התא שטופים משלב 2.6. יש לדגור במשך 15 דקות על קרח בחושך.
- המשך להגדרת ציטומטריית זרימה (סעיף 3).
3. הגדרת ציטומטר זרימה ורכישת נתונים
- העבירו את דגימות התא לצינורות התואמים למכשיר ציטומטריית הזרימה. הניחו את הצינורות על קרח ושמרו עליהם מוגנים מפני אור.
הערה: אם נצפים אגרגטים בתרחיפים של התא, העבירו את התרחיף דרך מסננות תאים של 70-100 מיקרומטר לפני הניתוח. אין להשתמש במסננות של 40 מיקרומטר מכיוון שהן יכולות להוציא חלק מהתאים המזדקנים הגדולים יותר.
- בתוכנה המוזכרת (ראה טבלת חומרים), פתח את החלקות הבאות: 1) FSC-A לעומת SSC-A dot plot, 2) היסטוגרמה של ערוץ סגול, 3) ערוץ אדום רחוק (למשל, APC-A) לעומת ערוץ ירוק (למשל, FITC-A) dot plot.
הערה: ניתן להשתמש גם בחלקות הרחקה כפולות והיסטוגרמות חד-ערוציות, אך הן אינן נדרשות בהחלט.
- ליזום רכישת נתוני ציטומטר.
- הניחו את דגימת בקרת הרכב בלבד מוכתמת ב-DDAOG על פתח היניקה. במהירות צריכה נמוכה, להתחיל לרכוש נתונים לדוגמה.
- התאם מתחי FSC ו- SSC כך ש- >90% מהאירועים ייכללו בעלילה. אם התאים אינם מתאימים היטב למשטח, הנמיכו את הגדרת שינוי קנה המידה של השטח ל- 0.33-0.5 יחידות.
- הסר את דגימת הרכב בלבד מבלי לרשום נתונים.
- (אופציונלי) הוסף טיפה אחת של מיקרוספרות כיול קשת לציטומטר עם 1 מ"ל PBS. הניחו את הצינור על יציאת צריכת הציטומטר. התחל לרכוש נתונים לדוגמה.
- התאימו את מתחי התעלה הסגולה, הירוקה והאדומה הרחוקה כך שהשיא העליון של מיקרספירת הקשת יהיה בטווח של 104-105 יחידות פלואורסצנטיות יחסית בכל ערוץ וכל הפסגות מופרדות היטב בכל ערוץ. שיא של 10,000 אירועים. הסר את הצינור.
- הניחו את דגימת הבקרה החיובית (לדוגמה, BLM, ETO) מוכתמת ב-DDAOG על יציאת הצריכה. במהירות נמוכה, לרכוש נתונים לדוגמה. התבונן באירועים בערוצים FSC, SSC, סגול, ירוק ואדום רחוק כדי להבטיח שלמעלה מ- 90% מהאירועים כלולים בכל המגרשים. חפש עלייה באות המיקוד האוטומטי וה-DDAOG לעומת בקרת הרכב בלבד.
- אם אתה משתמש בציטומטר מיון, התחל מיון בשלב זה.
- למטרות שמירת רשומות, רשום 10,000 תאים עבור דגימת הבקרה וכל מדגם ממוין.
- מיין את כמות התאים הרצויה (≥1 × 106 מתאים בדרך כלל) לתוך צינור איסוף מתאים מכשיר עם 3-5 מ"ל של מדיום תרבית.
- לאחר המיון, המשך לתרבות או ניתוח במורד הזרם.
הערה: עבור ציטומטר הזרימה המכויל המשמש כאן, מתחי התעלה האופטימליים ירדו בדרך כלל בין 250 ל -600 (טווח ביניים), אך המתחים האופטימליים וטווחי מתח התעלה ישתנו בין מכשירים שונים. הימנע משימוש במתחים בטווחים נמוכים או גבוהים מאוד, שעלולים לדכא אות או להגביר רעש.
- לאחר השלמת שלבים 3.1-3.5 וביצוע התאמות להגדרות הציטומטר לפי הצורך, רשום נתונים עבור כל הדגימות. ודא שההגדרות נשארות אחידות לכל הקלטות הדגימה. רשום ≥10,000 אירועים לכל דגימת תא בתרבית.
הערה: למרות שניתן לבצע gating וניתוח באמצעות תוכנה לרכישת נתונים (לדוגמה, FACSDiva), זרימת עבודה מלאה של gating וניתוח שתתבצע לאחר הרכישה באמצעות תוכנת ניתוח נפרדת (FlowJo) מתוארת בסעיף 4 להלן. ניתוח לאחר רכישה עדיף כדי לקצר את הזמן בעמדת העבודה ציטומטר ולנצל כלים נוספים הכלולים בתוכנת הניתוח הייעודית.
- שמור נתונים לדוגמה בתבנית קובץ .fcs. יצא את הקבצים למחשב תחנת עבודה המצויד בתוכנה לניתוח ציטומטריית זרימה (לדוגמה, FlowJo).
4. ניתוח נתוני ציטומטריית זרימה
הערה: זרימת העבודה המוצגת משתמשת בתוכנת FlowJo. ניתן להשתמש בתוכנה חלופית לניתוח נתוני ציטומטריית זרימה אם השלבים העיקריים המתוארים בסעיף זה מבוצעים באופן דומה.
- באמצעות תוכנת FlowJo, פתח קבצי נתונים מסוג .fcs משלב 3.7.
- פתח את חלון הפריסה.
- גרור ושחרר את כל הדוגמאות בחלון הפריסה.
- שער תאים קיימא.
- תחילה לחץ פעמיים על הנתונים לדוגמה עבור בקרת הרכב בלבד כדי לפתוח את חלון הנתונים שלה.
- הצג את הנתונים באופן חזותי כהיסטוגרמת ערוץ סגול. זהה את התאים בני קיימא המוכתמים על ידי CV450 בהתבסס על הפלואורסצנטיות הבהירה שלהם מאשר התאים המתים.
- צייר שער באמצעות כלי ההיסטוגרמה של שער יחיד כדי לכלול תאים בני קיימא בלבד. תן שם לשער בר קיימא.
- לאחר מכן, מחלון פריסת הדגימה, גרור את השער המעשי אל דגימות התאים האחרות כדי להחיל את השער באופן אחיד.
- בחלון הפריסה, הצג באופן חזותי את כל הדגימות כהיסטוגרמות של ערוץ סגול (כדאיות). ודא כי gating תאים קיימא מתאים על פני דגימות לפני שתמשיך; אם לא, בצע התאמות לפי הצורך.
הערה: הכתמת כדאיות יכולה להציג וריאציות בין טיפולים.
- שער תאים מזדקנים.
- לחץ פעמיים על נתוני התא המגודרים עבור בקרת הרכב בלבד כדי לפתוח את חלון הנתונים שלה.
- הצג באופן חזותי את הנתונים כתרשים נקודות עבור ערוץ אדום רחוק (DDAOG) לעומת ערוץ ירוק (AF).
- צייר שער באמצעות כלי החיתוך המלבני כדי לכלול <5% מהתאים שהם DDAOG+ ו- AF+ (הרביע הימני העליון). תן שם לשער הזקן.
- לאחר מכן, מחלון פריסת הדגימה, גרור את השער המזדקן אל תת-הקבוצות הקיימות של דגימות התאים האחרות כדי להחיל את השער באופן אחיד.
- בחלון הפריסה, גרור ושחרר את כל תת-קבוצות התאים הקיימות המגודרות בסעיף 4.4. הצג באופן חזותי את כל הדגימות הקיימות כתרשימי נקודות אדומים רחוקים (לדוגמה, APC-A) לעומת ערוצים ירוקים (לדוגמה, FITC-A).
- ודא כי השער המזדקן המשורטט בשלב 4.5.3 גלוי בכל החלקות וכי השער לבקרת הרכב בלבד מציג ≤5%-10% תאים מזדקנים.
- לאחר שאחוז התאים המזדקנים נקבע באמצעות השלבים לעיל, הצג את הנתונים המתקבלים באמצעות תרשימי FlowJo, המסוכמים בטבלת נתונים ו/או מנותחים סטטיסטית באמצעות תוכנה סטנדרטית.