$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת ריאגנטים
- מלחי מרה בינוניים: להכנת ציר סויה טריפטי (TSB) המכיל 0.4% מלחי מרה (משקל/נפח), יש להשהות 200 מ"ג מלחי מרה ב-50 מ"ל TSB אוטוקלאב. מסנן מעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. להכין מדיום טרי מדי שבוע.
הערות: מלחי המרה המשמשים באופן שגרתי הם תערובת של נתרן כולאט 1:1 ונתרן דאוקסיכולאט שבודדו מכיסי המרה של השחלות ושל הפרות. כפי שהודגם בעבר, נוכחות גלוקוז נדרשה ליצירת ביופילם המושרה על ידי מלח מרה. TSB הוסיף גלוקוז ביחס למרק לוריא-ברטאני (LB); ולכן, היה מספיק כדי לגרום להיווצרות ביופילם בשיגלה ובפתוגנים האנטרים האחרים שנותחו. בהתאם לחיידקים שיש לנתח, ייתכן שיהיה צורך בריכוזי גלוקוז שונים או בדרישות סוכר שונות.
- 0.5% w/v סגול קריסטלי במים: ממיסים 2.5 גרם של סגול קריסטלי במים מזוקקים של 500 מ"ל. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר.
2. הכנת חיידקים
- לגדל תרביות לילה של זני חיידקים כדי להיבדק על ידי חיסון 3 מ"ל של TSB עם מושבה אחת, מבודדת היטב בצינור תרבית סטרילי. דגירה ב 37 ° C עם ניעור ב 225 סל"ד עבור דגירה לילה (16 - 24 שעות).
הערה: זנים יש להחזיר ממלאי המקפיא כל 2 עד 4 שבועות ולשמור על צלחות לא יותר מ 2 שבועות.
3. בדיקת היצמדות לשלב מוצק
הערה: בדיקה זו מכמתת חיידקים דבקים בשיטת צלחת 96 באר. חיידקים גדלים באופן סטטי בצלחות תחתונות שטוחות. הכביסה מבוצעת כדי להסיר חיידקים שאינם דבקים וחיידקים דבקים מוכתמים בסגול קריסטל. הכתם הסגול הגבישי קושר פפטידוגליקן בדופן התא החיידקי וניתן להמיס אותו באמצעות אתנול. מספר החיידקים הדבקים נקבע על בסיס שימור סגול גבישי.
- הגדר שני צינורות 1.5 מ"ל. תווית עם TSB או TSB + מלחי מרה (BS).
- הוסף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS לצינורות המתאימים.
- לחסן צינורות עם 20 μL של תרבית לילה (בדילול 1:50).
- בצלחת סטרילית, שקופה, בעלת תחתית שטוחה, שטופלה בתרבית רקמה בת 96 בארות, הוסף 130 μL / באר של אמצעי בקרה לא מחוסנים לשלוש בארות שישמשו כבקרה ריקה. הגדר שלוש בארות בקרה עבור כל סוג מדיה (TSB ו- TSB + BS) לבדיקה.
- הוסף 130 μL / באר של תרבית מחוסנת לשלוש בארות וחזור על הפעולה עד שכל תנאי הניסוי מצופים במשולש.
- יש לדגור במשך 4 - 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס באופן סטטי.
- באמצעות קורא לוחות, הקלט את OD600. הגדר את בארות הבקרה כ'ריקות'. ודא שאמצעי הבקרה ברור ללא עדות לעכירות. אם מתגלה עכירות כלשהי, בטל את הניסוי. ניתן להשתמש בערכי OD600 כדי לנרמל את הנתונים אם יש הבדלים משמעותיים בקצב הגדילה בין זני חיידקים.
- מוציאים את מדיום התרבית באמצעות קו ואקום על ידי הטייה עדינה של הצלחת ושאיפה איטית של המדיום בקצה התחתון של הבאר. הקפידו לאסוף את כל מדיום התרבית מבלי להפריע לאוכלוסיית החיידקים הדבקים הממוקמת על משטח הפלסטיק. אם מטריצת פוליסכריד חוץ-תאי (EPS) הופקה במהלך זמן הדגירה, המטריצה תוצג כמשקע לבן. אל תפריע למטריצת EPS.
- שטפו בעדינות את הבארות פעם אחת עם 200 μL מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS). הסירו את שטיפת PBS באמצעות קו הוואקום.
- הופכים את הצלחת לייבוש. אפשר לפחות 20 דקות להתייבש.
הערה: מכיוון שיש לייבש היטב את הביופילם לפני הצביעה, ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה למספר שעות או אפילו למשך הלילה. זמן הייבוש הנוסף לא ישנה את הליך הצביעה ואילו ייבוש לא מלא ישפיע על כימות התוצאות ויכולת השחזור.
- הוסף 150 μL של 0.5% סגול קריסטל לכל ניסוי ובקר היטב.
- יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- לשטוף את הבארות פעם אחת עם 400 μL של מים מזוקקים. הנפח הנוסף מסייע להסיר שאריות של כתם סגול קריסטלי מצידי הבארות. הסירו את הכביסה עם קו הוואקום.
- לשטוף את הבארות חמש פעמים עם 200 μL של מים מזוקקים. הסירו את הכביסה עם קו הוואקום.
הערה: שטיפה יסודית חשובה לכימות. כאשר הבארות הריקות נקיות מהמים המזוקקים ואינן מכילות שאריות של כתם סגול קריסטלי, המשך לשלב הבא.
- הפוך את הצלחת לייבוש, מוגן מפני אור. יש להקפיד על ייבוש מלא של הצלחת כאמור לעיל.
- להכתים את הבארות עם 200 μL של 95% אתנול. דוגרים על הצלחת על השייקר למשך 30 דקות. כדי למנוע אידוי, במיוחד בטמפרטורות גבוהות יותר, בצע שלב זה ב 4 °C (75 °F).
- באמצעות קורא לוחות, רשום את הצפיפות האופטית ב- 540 (OD540).
הערה: אורך הגל לבליעה מרבית של סגול גבישי הוא קרוב ל-590 ננומטר. הספרות מדווחת על טווח בין OD540 - OD595 לספיגת קריסטל סגול; לכן בחרו אורך גל זמין בהתאם לקורא הלוחות.