בדיקה לחקר היווצרות ביופילם המושרה על ידי מלח מרה באמצעות זיהוי מטריצת EPS

תקציר

מקור: Nickerson, K. P., et al. Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים שיטה מבוססת פלואורסצנטיות לכימות היווצרות ביופילם המושרה על ידי מלח מרה. עם הוספת מלחי מרה בתרבית של חיידק אנטרי פתוגני, ייצור ביופילם מזוהה באמצעות לקטין פלואורסצנטי הנקשר לרב-סוכרים במטריצת החומר הפולימרי החוץ תאי (EPS) של הביופילם.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים

1. מלחי מרה (BS) בינוניים: להכנת ציר סויה טריפטי (TSB) המכיל 0.4% מלחי מרה (משקל/נפח), יש להשהות 200 מ"ג מלחי מרה ב-50 מ"ל TSB אוטוקלאב. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר. הפוך בינוני טרי בשבועון.
   הערות: מלחי המרה המשמשים באופן שגרתי הם תערובת של נתרן כולאט 1:1 ונתרן דאוקסיכולאט שבודדו מכיסי המרה של השחלות ושל הפרות. כפי שהודגם בעבר, נוכחות גלוקוז נדרשה ליצירת ביופילם המושרה על ידי מלח מרה. TSB הוסיף גלוקוז ביחס למרק לוריא-ברטאני (LB); ולכן, היה מספיק כדי לגרום להיווצרות ביופילם בשיגלה ובפתוגנים האנטרים האחרים שנותחו. בהתאם לחיידקים שיש לנתח, ייתכן שיהיה צורך בריכוזי גלוקוז שונים או בדרישות סוכר שונות.
2. 0.5% w/v סגול קריסטלי במים: ממיסים 2.5 גרם של סגול קריסטלי במים מזוקקים של 500 מ"ל. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר.
3. Concanavalin A (ConA) מצומד לאיזותיוציאנט פלואורסצאין (FITC): מרכיב מחדש את המניה ב- 1x PBS. יש לדלל את הציר המרוכז של 10 מ"ג ב-400 מיקרוליטר של 1x PBS לריכוז סופי של 25 מק"ג/מ"ל, ולהגן מפני אור.
4. PBS + גלוקוז: להמיס 0.2 גרם גלוקוז ב 10 מ"ל 1x PBS (2% w / v גלוקוז סופי). יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש להכין טרי ביום השימוש.
5. PBS + מלחי מרה: ממיסים 40 מ"ג ב-10 מ"ל 1x PBS (0.4% עם מלחי מרה סופיים). יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש להכין טרי ביום השימוש.
6. PBS + גלוקוז ומלחי מרה: ממיסים 40 מ"ג מלחי מרה ו-0.2 גרם גלוקוז ב-10 מ"ל 1x PBS (0.4% מלחי מרה w/v ו-2% w/v גלוקוז סופי). יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש להכין טרי ביום השימוש.
7. הכינו צלחות אגר LB.
8. תיקון פורמלדהיד/גלוטראלדהיד: הוסף 810 μL פורמלדהיד (37% תמיסת מלאי, ריכוז סופי של 3%) ו-125 μL גלוטראלדהיד (25% תמיסת מלאי, ריכוז סופי של 0.25%) ל-14 מ"ל 1x PBS. מערבבים היטב ומאחסנים ב-4°C. התיקון צריך להיות קר לשימוש נכון.
   זהירות: התיקון רעיל ודורש השלכת פסולת מסוכנת.
9. תמיסה נגד דעיכה: השתמש בתמיסת הרכבה נגד דעיכה המכילה כתם 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי לעכב הלבנה של דגימות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית תוך צביעה פלואורסצנטית של ה- DNA של החיידקים.

2. הכנת חיידקים

1. לגדל תרביות לילה של זני חיידקים כדי להיבדק על ידי חיסון 3 מ"ל של TSB עם מושבה אחת, מבודדת היטב בצינור תרבית סטרילי. יש לדגור ב-37°C עם טלטול ב-225 סל"ד לדגירה למשך הלילה (16 - 24 שעות).
   הערה: זנים צריכים להיות rereaked מן מלאי מקפיא כל 2 עד 4 שבועות, ונשמר על צלחות לא יותר מ 2 שבועות.

3. EPS זיהוי מטריצה

הערה: בדיקות משלימות אלה מכמתות וממחישות את EPS. בשניהם, EPS מזוהה באמצעות לקטין כדי לקשור סוכרים. החלבון המצומד פלואורסצנטית מאפשר כימות.

1. זיהוי כמותי למחצה של EPS
   1. הגדר שני צינורות 1.5 מ"ל. תווית עם TSB או TSB + BS.
   2. הוסף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS לצינורות המתאימים.
   3. לחסן צינורות עם 20 μL של תרבית לילה (דילול 1:50).
   4. בצלחת סטרילית, שחורה, בעלת תחתית שטוחה, שטופלה בתרבית רקמה בת 96 בארות, הוסף 130 מיקרוליטר לבאר של אמצעי בקרה לא מחוסנים לשלוש בארות שישמשו כבקרה הריקה. הגדר שלוש בארות בקרה עבור כל סוג בינוני לבדיקה. הוסיפו לבארות 130 מיקרוליטר/באר של תרבית מחוסנת, וחזרו על הפעולה עד שכל תנאי הניסוי מצופים בשלשה.
   5. יש לדגור במשך 4 - 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס באופן סטטי.
   6. מעבירים את מדיום התרבית לצלחת שקופה של 96 בארות עם פיפטה, רצוי פיפטה רב ערוצית. היזהר לאסוף את כל מדיום התרבות מבלי להפריע לאוכלוסיית המאמינים ו / או EPS הממוקם על משטח הפלסטיק. מניחים בצד.
   7. תקן את הצלחת השחורה למשך 15 דקות ב- RT באמצעות 200 μL / well של פורמלדהיד / גלוטראלדהיד ב- 1x PBS.
   8. בזמן שאוכלוסיית החסידים מתקבעת, העריכו את השבר העל-טבעי משלב 1.1.6. באמצעות קורא לוחות, הקלט את OD_600. הגדר את בארות הבקרה כ'ריקות'. ודא שאמצעי הבקרה ברור ללא עדות לעכירות. אם מתגלה עכירות כלשהי, בטל את הניסוי.
      1. לחלופין, ניתן לבצע את הבדיקה כולה בלוח תחתון שחור ושקוף. בנסיבות אלה, ניתן לרשום את ערכי OD₆₀₀ ולאחר מכן למחוק את מדיום התרבות לפני שתמשיך לשלב 3.1.7. ניתן להשתמש בערכי OD₆₀₀ כדי לנרמל את הנתונים במקרה שיש הבדלים משמעותיים בקצב הגדילה בין זני חיידקים.
   9. הסר את התיקון והשלך לפסולת המסוכנת.
   10. לשטוף בעדינות את הבארות פעמיים עם 200 μL / באר של PBS סטרילי. הסירו את שטיפת PBS באמצעות קו הוואקום על ידי הטייה עדינה של הצלחת ושאיפה איטית של השטיפה בקצה התחתון של הבאר.
   11. הוסף 150 μL / באר של 25 מיקרוגרם / מ"ל ConA-FITC, ודגרה במשך 15 דקות ב RT.
   12. יש לשטוף בעדינות פעמיים עם 200 μL של PBS.
   13. הוסף 150 μL של PBS לכל באר. רשום את הפלואורסצנטיות ב 488 ננומטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מרק סויה טריפטי	סיגמא-אולדריץ'	22092-500 גרם
Concanavalin-A FITC	סיגמא	C7642-10 מ"ג
גלוקוז	סיגמא	G7021-1KG
מלחי מרה	סיגמא	B8756-100G
ל.ב. אגר	סיגמא	L7533-1 ק"ג
14 מ"ל צינורות תרבית, 17 x 100 מ"מ, פלסטיק, סטרילי	פישר	14-959-11ב
Vectashield אנטי-דהייה קשה עם DAPI	מעבדות וקטוריות	H-1500
פורמלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	F1635-500
גלוטראלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	G6257
צלחות בעלות תחתית שטוחה של 96 בארות (שקופות)	TPP	92696
צלחות בעלות תחתית שטוחה של 96 בארות (שחור)	גריינר ביו-וואן	655076
צלחות שטוחות עם תחתית של 24 בארות (שקופות)	TPP	92424
קורא צלחות 96 בארות	ספקטרמקס
קורא צלחות קמח	ביוטק סינרגיה 2
מיקרוסקופ קונפוקלי או פלואורסצנטי	מיקרוסקופ קונפוקלי Nikon A1
אינקובטור טלטול 37°C	ניו ברנזוויק סיינטיפיק אקסלה E25
אינקובטור לוחות 37°C	סדרת תרמולין 5000