1. הכנת ריאגנטים
- מלחי מרה בינוניים: להכנת ציר סויה טריפטי (TSB) המכיל 0.4% מלחי מרה (משקל/נפח), יש להשהות 200 מ"ג מלחי מרה ב-50 מ"ל TSB אוטוקלאב. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר. הפוך בינוני טרי בשבועון.
הערות: מלחי המרה המשמשים באופן שגרתי הם תערובת של נתרן כולאט 1:1 ונתרן דאוקסיכולאט שבודדו מכיסי המרה של השחלות ושל הפרות. כפי שהודגם בעבר, נוכחות גלוקוז נדרשה ליצירת ביופילם המושרה על ידי מלח מרה. TSB הוסיף גלוקוז ביחס למרק לוריא-ברטאני (LB); ולכן, היה מספיק כדי לגרום להיווצרות ביופילם בשיגלה ובפתוגנים האנטרים האחרים שנותחו. בהתאם לחיידקים שיש לנתח, ייתכן שיהיה צורך בריכוזי גלוקוז שונים או בדרישות סוכר שונות.
- 0.5% w/v סגול קריסטלי במים: ממיסים 2.5 גרם של סגול קריסטלי במים מזוקקים של 500 מ"ל. מסנן מעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
- מלח חוצץ פוספט (PBS) + גלוקוז: להמיס 0.2 גרם גלוקוז ב 10 מ"ל 1x PBS (2% w / v גלוקוז סופי). מסנן מעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. יש להכין טרי ביום השימוש.
- PBS + מלחי מרה: ממיסים 40 מ"ג ב-10 מ"ל 1x PBS (0.4% עם מלחי מרה סופיים). יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש להכין טרי ביום השימוש.
- PBS + גלוקוז ומלחי מרה: ממיסים 40 מ"ג מלחי מרה ו-0.2 גרם גלוקוז ב-10 מ"ל 1x PBS (0.4% מלחי מרה w/v ו-2% w/v גלוקוז סופי). מסנן מעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. יש להכין טרי ביום השימוש.
- הכינו צלחות אגר LB.
2. הכנת חיידקים
- לגדל תרביות לילה של זני חיידקים כדי להיבדק על ידי חיסון 3 מ"ל של TSB עם מושבה אחת, מבודדת היטב בצינור תרבית סטרילי. דגירה ב 37 ° C עם ניעור ב 225 סל"ד עבור דגירה לילה (16 - 24 שעות).
הערה: יש להזרים מחדש את הזנים ממלאי המקפיא כל שבועיים עד 4 שבועות ולשמור אותם על צלחות בנות לא יותר משבועיים.
3. בדיקת פיזור
הערה: בבדיקה זו מזוהה פירוק הביופילם באמצעות פיזור חיידקים. כאן, ביופילמים בוגרים מוקמים ולאחר מכן (בדרך כלל למחרת), התקשורת מוחלפים עם PBS או PBS משלימים. לאחר מכן מעריכים את מרכיב העל-נאטנט כדי לכמת את מספר החיידקים שהתנתקו מהביופילם.
- הגדר שני צינורות 1.5 מ"ל. תווית עם TSB או TSB + BS (מלחי מרה).
- הוסף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS לצינורות המתאימים.
- לחסן צינורות עם 20 μL של תרבית לילה (בדילול 1:50).
- בצלחת סטרילית, שקופה, בעלת תחתית שטוחה, שטופלה בתרבית רקמה בת 96 בארות, הוסף 130 μL / באר של אמצעי בקרה לא מחוסנים לשלוש בארות שישמשו כבקרה ריקה. הגדר שלוש בארות בקרה עבור כל סוג מדיה לבדיקה.
- הוסף 130 μL / באר של תרבית מחוסנת לשלוש בארות וחזור על הפעולה עד שכל תנאי הניסוי מצופים במשולש.
- לדגור את הצלחת במשך 4 - 24 שעות ב 37 ° C סטטית.
- לפני שתמשיך, לחמם את PBS, PBS + גלוקוז, PBS + מלחי מרה, ו PBS + מלחי מרה + גלוקוז ל 37 ° C. להכין ריאגנטים אלה טריים מדי יום.
- באמצעות קורא לוחות, הקלט את הצפיפות האופטית, OD600. הגדר את בארות הבקרה כ'ריקות'. ודא שהמדיום ברור ללא עדות לעכירות. אם מתגלה עכירות כלשהי, בטל את הניסוי. ניתן להשתמש בערכי OD600 כדי לנרמל את הנתונים אם יש הבדלים משמעותיים בקצב הגדילה בין זני חיידקים.
- הסר את מדיום התרבית באמצעות קו ואקום. הקפידו לאסוף את כל מדיום התרבית מבלי להפריע לאוכלוסיית המאמינים הממוקמת על משטח הפלסטיק.
- לשטוף בעדינות את הבארות פעמיים עם 200 μL / באר של PBS סטרילי. הסירו את שטיפת PBS באמצעות קו הוואקום.
- החליפו את השטיפה ב-130 מיקרוליטר/באר מהבאים לשלוש בארות כל אחת: PBS, PBS + גלוקוז, PBS + מלחי מרה, ו-PBS + מלחי מרה + גלוקוז. ריאגנטים אלה חייבים להיות מחוממים מראש ל 37 °C (77 °F).
- לדגור על הצלחת במשך 30 דקות ב 37 ° C.
- בזהירות להסיר את הצלחת מן האינקובטור 37 מעלות צלזיוס. מעבירים את הסופרנאטנטים לצלחת טרייה וסטרילית בת 96 בארות.
- בעזרת צלחת 96 בארות או בלוק דילול, הכינו דילול סדרתי פי 10 (1:10) של הסופרנאטנט ל-PBS סטרילי.
הערה: סדרת הדילול צריכה לנוע בין לא מדולל ל 10-6 בהתאם לזן החיידקי שייבדק. ניתן לבצע ניסויי פיילוט כדי לקבוע את טווח הדילול האופטימלי.
- ספוט צלחת 5 μL של כל דילול על אגר LB באמצעות פיפטה רב ערוצית. לדגור ב 37 °C (77 °F) במשך הלילה. ספור מושבות למחרת וקח בחשבון את גורם הדילול בעת קביעת יחידות יצירת מושבת התאוששות (CFU). כדי לחשב את אחוז הפיזור ביחס לפקד PBS 1x (מוגדר על 100%), חלק את CFU ההתאוששות מכל תנאי טיפול על ידי CFU ההתאוששות ממדגם הבקרה 1x PBS.
הערה: ניתן להשתמש גם בצלחות מדיה שגרתיות לזן החיידקי המעניין. לדוגמה, Shigella יכול להיות מצופה על לוחות אדומים קונגו. ודאו שהלוחות יבשים לטכניקות ציפוי נקודתיות מתאימות.
