$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת ביופילם חוץ גופי של חיידקים במושבת הפטריות
- צנטריפוגה את תרבית החיידקים ב 5,000 x גרם במשך 3 דקות ולהשהות את הגלולה ב 25 מ"ל של חיץ סטרילי 0.1 M אשלגן פוספט (25 גרם / L KH2PO4 ו 2.78 גרם / L K2HPO4, pH 5.8). חזור על שלב זה פעם אחת והתאם את ריכוז החיידקים הסופי ל -109 תאים / מ"ל עם אותו חיץ.
- ממלאים צלחת מיקרו 6 בארות עם 5 מ"ל של תרחיף החיידקים (או סטרילי 0.1 M אשלגן פוספט חיץ עבור הבקרה השלילית).
- חותכים את קרום הצלופן של התרבות הפטרייתית עם סכין גילוח סטרילי כדי לקבל ריבועים של צלופן עם מושבה פטרייתית אחת על כל ממברנה. הסר בזהירות את ריבועי הצלופן המכילים קורים מהתווך המוצק באמצעות מלקחיים והעבר את ריבוע הצלופן המכיל קורים לבאר של צלחת המיקרו המכילה את התרחיף החיידקי.
- נערו בעדינות את צלחת המיקרו בזמן שהמושבות הפטרייתיות עדיין מחוברות לצלופן; לאחר מכן, הסירו את יריעות הצלופן, ומשאירים את מושבות הפטריות בצלחת.
- לדגור על המיקרו-צלחת בתסיסה עדינה (~ 60 סל"ד) בטמפרטורה המותאמת למיקרואורגניזמים הנחקרים.
הערה: זמן הדגירה תלוי במהירות הקמת הביופילם ובשלב שיש לנתח. עבור P. fluorescens BBc6/L. bicolor, יש לדגור בטמפרטורה של 20°C למשך 30 דקות כדי לקבל ביופילמים בשלב מוקדם ועד 16 שעות כדי לקבל ביופילמים בוגרים.
2. סריקת לייזר ניתוח מיקרוסקופ קונפוקלי של היווצרות הביופילם
- הכנת דוגמאות
- כדי להסיר חיידקים פלנקטוניים וחיידקים המחוברים אלקטרוסטטית לקורים, שטפו את הפטרייה על ידי העברתה למיקרו-צלחת חדשה בת 6 בארות מלאה ב-5 מ"ל של תמיסת מלח חזקה (NaCl, 17 גרם/ליטר); נערו בעדינות במשך דקה.
- מעבירים את הפטרייה למיקרו-צלחת חדשה בעלת 6 בארות המכילה 5 מ"ל של חיץ אשלגן פוספט סטרילי בנפח 0.1 מ', מנערים בעדינות למשך 2 דקות ומעבירים את הפטרייה למאגר אשלגן פוספט טרי.
- חתכו את החלק של מושבת הפטרייה כדי להיות מצולם עם אזמל תוך שמירה אותו במאגר אשלגן פוספט, כך החלק המתקבל מכיל כמחצית המושבה הפטרייתית.
- כדי להכתים את הדגימה, העבירו אותה לצלחת פטרי מלאה במים סטריליים המכילים צבע פלואורסצנטי מתאים (בהתאם למטרת הניתוח), ודגרו עליה בחושך.
- כדי להמחיש את הרשת הפטרייתית, השתמש, למשל, באדום קונגו (ריכוז סופי של 0.1%, 5 דקות דגירה), לקטין אגלוטין של נבט חיטה (WGA) מצומד ל- Alexa Fluor 633 (ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל, 10 דקות דגירה) או FUN1 (ריכוז סופי של 10 מיקרומטר, 10 דקות דגירה).
- אם אתם משתמשים בחיידק שאינו מתויג כפלואורסצנטי, כתם נגדי את תאי החיידק בבדיקה פלואורסצנטית ספציפית לדנ"א מבין צבעי הדנ"א הרבים הזמינים באופן מסחרי. לדוגמה, השתמש ב- DAPI (ריכוז סופי של 0.25 מיקרוגרם/מ"ל, 10 דקות דגירה).
- כדי לדמיין את חלבוני המטריצה, השתמש בכתם חלבון.
- לאחר הצביעה, שטפו את הדגימה על ידי העברתה למכסה צלחת פטרי המכיל 10 מ"ל אשלגן פוספט סטרילי 0.1 M ונערו בעדינות במשך דקה.
- חצי לטבול שקופית במכסה צלחת פטרי ולהביא בעדינות את החלק החתוך לצוף מעל המגלשה. לאחר מכן, הסר באיטיות את השקופית מתמיסת המאגר, ואפשר לדגימה להתיישב בעדינות על השקופית.
הערה: עבור שלב זה, חשוב מאוד להמשיך בעדינות כדי למנוע הפרעה biofilm.
- לבסוף, הוסף 10 μl של אמצעי הרכבה נגד דהייה למדגם וכסה אותו עם כיסוי זכוכית.
הערה: לאחר הכנת השקופית, יש לבצע את הניתוח המיקרוסקופי בהקדם האפשרי (תוך 30 דקות לכל היותר) כדי למנוע שינוי במבנה הביופילם.