ניתוח בזמן אמת של נדידת תאי T באזורי גידול שונים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

תקציר

מקור: Peranzoni, Elisa, et al. ex vivo הדמיית לימפוציטים מסוג CD8 T בפרוסות גידולי ריאה אנושיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר הדמיה של תאי CD8 T חודרי גידול תושבים המסומנים בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטית בתוך פרוסות גידולי ריאה אנושיים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח בזמן אמת של נדידת תאי CD8 T באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

פרוטוקול

1. Immunostaining של תאי CD8 T תושב ותאי גידול

1. לדלל את הנוגדנים (ריכוז סופי 10 מיקרוגרם / מ"ל) ואת הצבע הגרעיני (ריכוז סופי 1 מיקרוגרם / מ"ל) במדיה RPMI-1640 ללא פנול אדום.
   הערה: השתמש בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטית נגד CD8 (מורין IgG, שיבוט SK1) ואנטי-EpCAM (מולקולת הידבקות תאי אפיתל) (מורין IgG HEA-125) כדי לסמן לימפוציטים מסוג CD8 T ותאי אפיתל גידוליים, בהתאמה. השתמש בנוגדן אנטי-CD90/Thy1 מצומד פלואורסצנטית (murine IgG, clone 5E10) כדי לתייג פיברובלסטים ותאי אנדותל פעילים. השתמש 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי לתייג את גרעין התאים עם קרום פלזמה פגום על מנת להעריך את כדאיות הרקמה.
2. מוציאים את לוחות התרבית מהאינקובטור ומשתמשים בפיפטה כדי לשאוב נוזל כלשהו בתוך מכונות הכביסה מנירוסטה. אין להסיר את המדיה 1.1 מ"ל RPMI-1640 הממוקמת מתחת לתוספות תרבית התא.
3. מבלי לגעת בפרוסה ולהשתמש בקצה פיפטה, מוסיפים 40 מיקרוליטר של התמיסה המכילה את הנוגדנים על כל פרוסת גידול.
4. יש לדגור על הצלחת בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות כדי לאפשר צביעת נוגדנים.
5. בעזרת מלקחיים עדינים, מוציאים את מכונות הכביסה, מוציאים את הפרוסות וטובלים אותן 10 שניות במדיה RPMI-1640 ללא פנול אדום. החזירו את הפרוסות לתוספות תרבית התאים והוסיפו טיפה של מדיום RPMI-1640 ללא פנול אדום על כל פרוסה בנפרד. שמרו על הצלחת בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות. המשך להדמיה.

2. הדמיה וניתוח נדידת תאי CD8 T בתוך פרוסות גידולי ריאה אנושיים

הערה: המיקרוסקופ הקונפוקלי המשמש בפרוטוקול זה הוא דיסק מסתובב זקוף המצויד במטרה טבילה במים פי 25 (25x/0.95 N.A).

1. הכנת מערך מיקרוסקופ
   1. הגדר את הטמפרטורה של תא החום של המיקרוסקופ על 37 ° C כמה שעות לפני תחילת ההדמיה.
   2. הגדר מערכת כדי לנקב כל הזמן פרוסות גידול עם מחומצן (5% CO₂, 95% O₂) פנול ללא סל"ד אדום מדיום (איור 1). השתמשו במשאבה פריסטלטית כדי להזרים את אמצעי הזילוח לתוך תא ההדמיה ושאפו את התמיסה לצלוחית איסוף פסולת.
   3. הפעל את המשאבה הפריסטלטית כדי לאפשר לתמיסה המחומצנת לעבור דרך צינורות הזילוח.
2. בעזרת מלקחיים עדינים, מוציאים את הפרוסה מצלחת 6 הבארות ומעבירים אותה לצלחת פלסטיק בקוטר 35 מ"מ מלאה בתווך סל"ד אדום נטול פנול. לשתק את הפרוסה עם עוגן פרוסה בקוטר 19.7 מ"מ עם חוטים מרווחים של 2 מ"מ. הניחו את צלחת הפטרי על שלב ההדמיה של המיקרוסקופ. חבר את קצות הכניסה והשקע של מערכת הזלוף. הפעל את מערכת הזילוח והגדר את קצב זרימת המדיה ל- 0.8 מ"ל/דקה.
3. מנמיכים את יעד הטבילה במים לפרוסה. התמקדו בחלק העליון של הפרוסה באור שדה בהיר. באמצעות אור פלואורסצנטי מתאים, בחר אזור עניין המכיל תאי CD8 T, איים סרטניים (חיובי עבור EpCAM), ואזור סטרומה (חיובי עבור CD90). בדוק את הכדאיות של תאים בתוך הפרוסה על ידי הערכת צביעת DAPI במשטח החתוך ועמוק יותר לתוך הרקמה.
   הערה: פרוסה בריאה מכילה רק מיעוט של תאים חיוביים ל-DAPI במרחק של כמה מיקרונים מהמשטח החתוך.
4. הגדר הפעלת הדמיה עם הפעולות הבאות.
   1. בהתאם לעוצמת האות הפלואורסצנטי של 3 הפלואורופורים, הגדר את זמן החשיפה בין 50 ל -800 מילישניות ואת עוצמת הלייזר בין 20 ל -40%.
   2. בחר את עובי ערימת z לתמונה בתוך פרוסת הגידול.
      הערה: כאן נלכדו 10-12 מטוסים אופטיים בעומק כולל של 60-70 מיקרומטר בממד z.
   3. בחר את מיקום ההתחלה בערך 10 מיקרומטר מתחת לתאי CD8 T המסומנים הראשונים.
   4. הגדירו את מרווח הזמן בין כל תמונת z stack בין 10 ל-30 שניות ואת זמן ההקלטה הכולל בין 10 ל-30 דקות.

תוצאות

איור 1: תצלומים של מערכת הזילוח. A) תמיסת RPMI ללא אדום פנול מועשרת ב 5% CO₂, 95% O₂. ב) התמיסה מחוררת לאחר מכן על ידי משאבה פריסטלטית. ג) פתרון הסל"ד נכנס לצלחת התרבית דרך המפרצון. בשקע, הפתרון הוא שואף על ידי המשאבה מן החדר לתוך מיכל פסולת. שים לב שקצה השאיפה מוגדר ברמה כדי לקבוע את גובה התמיסה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף	לייקה	מומלץ להשתמש בקונקוקל דיסק מסתובב
תוכנת Imaris	ביטפליין		תוכנה זו משמשת להדמיה של תמונות ומעקב אחר נדידת תאי T
מלקחיים עדינים	מכשירים מדויקים בעולם	14142
30 מ"מ תוספות תרבית	מיליפור	PICM0RG50
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) בינוני, תוסף GlutaMAX	תרמופישר	61870010	RPMI-medium מלא נעשה על ידי הוספת 10% סרום עגל עוברי מומת בחום ופניצילין/סטרפטומיצין
מלח חוצץ פוספט (PBS)	תרמופישר	20012019
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)	Invitrogen	14170088
טמפרטורת ג'לינג נמוכה Agarose, סוג VII-A	סיגמא-אולדריץ'	A0701
דבק בוטיל ציאנואקרילט לא רעיל, Vetbond	3 דקות	1469
עוגני פרוסה, קוטר 19.7, חוטי מרווח 2 מ"מ	וורנר אינסטרומנטס	64-1415
מכונות כביסה מנירוסטה, בקוטר פנימי של 5 מ"מ	אמזון	B004K1FDGQ
BV605-מצומד נגד CD8 (שיבוט SK1)	BD Biosciences	565289
FITC-conjugated anti-EpCAM (שיבוט HEA-125)	Miltenyi ביוטק	130-098-113
BV510-מצומד נגד CD90 (שיבוט 5E10)	ביואגדה	328125
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI	תרמופישר	D1306