הערה: פרוטוקול זה מדגיש את השימוש בציטומטריית זרימת FRET לאיתור פעילות זריעה מדגימות ביולוגיות של עכברים. הוא תואם גם לסיבים רקומביננטיים ולדגימות ביולוגיות אנושיות. המתת חסד עכברים וקצירת מוח בוצעו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי IACUC.
1. מיצוי המוח
- לאחר הרדמה עמוקה עם איזופלורן (2%), יש לנקב עכבר עם PBS קר כקרח המכיל 0.03% הפרין, ולחלץ את המוח בהתאם לפרטים המתוארים ב- Gage et al.
- מניחים רקמות שחולצו בבקבוקון הקפאה, ומקפיאים במהירות על ידי הכנסת חנקן נוזלי. לחלופין, יש להקפיא רקמות על קרח יבש. לאחר ההקפאה, להעביר רקמות ל -80 °C ולאחסן לתקופה ממושכת של זמן, במידת הצורך.
הערה: פרוטוקול זה תואם להומוגנאטים שלמים במוח או לאזורי מוח שעברו מיקרו-ניתוח. ראו Hagihara et al.לפרוטוקול מיקרו-דיסקציה מפורט.
2. הכנת חומר זרע ביולוגי
- הכינו מאגר הומוגניזציה על ידי המסת מעכבי פרוטאז (ללא חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) ל-1x TBS (מלח חוצץ טריס, טבליה אחת לכל 10 מ"ל). מערבלים במרץ, ומאחסנים על קרח. מעכבי פרוטאז חייבים להיות נטולי EDTA על מנת לשמר את יכולת הקיום של תאי ביו-סנסור.
- שוקלים רקמת מוח קפואה בסירת שקילה חד פעמית, ומעבירים לצינורית חרוטית 5 מ"ל. הוסף חיץ הומוגניזציה קר כקרח כך שהפתרון הסופי יהיה 10% משקל/נפח. יש לאחסן באופן זמני על קרח. מסת הרקמה ונפח חיץ ההומוגניזציה שלאחר מכן ישתנו בהתאם לגודל המוח ו/או האזורים שבהם נעשה שימוש. כאן, חצי מוח עכבר בוגר במשקל 0.2 גרם מושעה ב-2 מ"ל לתמיסת w/vol של 10%.
- העבירו דגימות לחדר קר, והתאימו סוניק בדיקה להגדרות המתאימות. עבור סוניקציה בדיקה עם Omni Ruptor (מוצג כאן), הגדר את ההספק ל -20%, המתאים לכ- 75 W. השתמש במצב פולס כדי להבטיח שהדגימות אינן מתחממות יתר על המידה במהלך סוניקציה. הגדר את הפולס ל -30%, המקביל לכ- 500 מילישניות.
- נקה את קצה הסוניקטור של הבדיקה על ידי שטיפה במים, איזופרופנול ומים שוב, וניגב את הבדיקה בין כל תמיסה. הקפידו לשטוף ולנגב את הצדדים והתחתון של הבדיקה עם מגבוני מעבדה.
- בעבודה עם דגימה אחת בכל פעם, השקיעו את קצה הגשושית במאגר ההומוגניזציה והפעילו את הסוניקטור. באמצעות הגדרות הכוח והפולס המתוארות לעיל, ספק 25 פעימות בסך הכל. ודא כי הרקמה היא לחלוטין השעיה. היזהר כדי למנוע קצף של הדגימה במהלך שלב זה.
הערה: דגימות רגישות לקצף אם א) הנפח הכולל נמוך או ב) ההומוגנט מתחמם. עם מכשיר ספציפי זה, לא sonicate עם נפחים פחות מ 250 μl. כדי להבטיח שהדגימות יישארו מקוררות, ניתן לאחסן צינורות על קרח במהלך שלב זה.
- נקו את הגשושית על ידי ניגוב שאריות הליזט, ולאחר מכן העבירו 10 פולסים לתוך מים נקיים. יש לשטוף שוב את הצדדים והתחתית של הבדיקה במים, איזופרופנול ומים (כמו בשלב 2.4), תוך ניגוב יבש בין כל שלב. כדי למנוע זיהום, שטפו היטב את הבדיקה בין הדגימות.
הערה: עם אגרגטים של טאו, לא מצאנו שיש צורך בשיטות ניקוי מחמירות יותר למניעת זיהום מדגימה לדגימה. עמילואידים אחרים, לעומת זאת, עשויים לדרוש טיפול נוסף אשר תואר בהרחבה בספרות.
- אחסנו הומוגנאטים על קרח עד שכל הדגימות יעובדו.
- ספין הומוגנטים ב 21,300 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
- מעבירים את הסופרנאטנט לצינור נקי, תוך הקפדה שלא להפריע לכדור. השליכו את הכדור. Aliquot supernatant, ולאחסן lysates ב -80 ° C לשימוש נוסף. עם זאת, הימנעו ממחזורי הקפאה/הפשרה של ההומוגנאטים, מכיוון שהדבר מפחית את יעילות הזריעה.
3. ציפוי מחדש של תאי Biosensor
הערה: השתמש בארבע שורות תאים עבור בדיקה זו: HEK 293T (קו תא #1), RD-P301S-CFP (קו תא #2), RD-P301S-YFP (קו תא #3) ו- RD-P301S-CFP/YFP (קו תא #4). עיין בטבלה 1 עבור תרומתה של כל שורה סלולרית לבדיקה.
- בסביבה סטרילית, שאפו למדיום תרבותי. יש לשטוף תאים במי מלח חוצצי פוספט חם (PBS), ולשאוף. תאי טריפסיניזציה (3 מ"ל טריפסין-EDTA (0.05%)) למשך 3 דקות, מרווה עם מדיום תרבית חמה (9 מ"ל DMEM, 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1% גלוטמקס), ומיד להעביר תאים לצינור חרוט.
- תאי צנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוף תווך, ו resuspend תא גלולה בתווך תרבית חמה.
- באמצעות המוציטומטר, לקבוע את צפיפות התא עבור כל קו התא. צפיפות התאים תשתנה בהתאם למפגש בזמן הקציר ונפח התלייה. תאי השהיה שנקטפו מצלחת של 10 ס"מ במפגש של 90% במדיה של 10 מ"ל, כדי שצפיפות התאים תהיה כמיליון תאים/מ"ל.
- צור תערובת אב של תאים + מדיה כך שכל באר של צלחת 96 בארות תכיל 35,000 תאים במדיה של 130 מיקרוליטר (למשל, כדי ליצור תערובת אב עבור 100 בארות, השהה מחדש 3.5 מיליון תאים במדיה של 13 מ"ל). שנה את מספר התא כך שיתאים לעיצובים ניסיוניים בודדים ולצירי זמן. לטיפול בתאים ~ 18 שעות לאחר הציפוי, הוסף 35,000 תאים לכל באר של צלחת 96 בארות.
- באמצעות פיפט רב ערוצי, פיפטה איטית 130 μl של תרחיף תא מאסטר לערבב לתוך כל באר של תחתית שטוחה, תרבית רקמה 96 צלחת באר. בזמן הציפוי, מניחים את קצה הפיפט במרכז הבאר, ולא נוגעים בתחתית הצלחת.
הערה: למרות שניתן לשנות את פורמט הציפוי, מומלץ ליצור n = 4 בארות עבור כל אחד מקווי התא 1-3 לכל צלחת. שאר הצלחת (n = 84) שמורה לקו תא #4 (תאי ביוסנסורה).
- אפשרו לתאים לשקוע על ידי השארת הצלחת ללא הפרעה למשך 10 דקות ב-RT. דגרו O/N בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 ו-≥80% לחות יחסית.
4. טיפול בתאים
הערה: למחרת, כאשר תאי biosensor tau הם 60-65% confluent, להכין מתחמי התמרה זרעים כדלקמן:
- בצינור אחד, שלבו מגיב טרנספקציה, כגון Lipofectamine, עם מדיה מופחתת בסרום, כגון Opti-MEM, כדי ליצור תערובת מאסטר. לכל באר, להוסיף 1.25 μl מגיב transfection ו 8.75 μl מדיה מופחתת בסרום. יש לערבב בעדינות את הצינור, לסובב לזמן קצר ולדגור במשך 5 דקות ב-RT.
- בצינור אחר, לשלב חומר זרע (aliquot של lysate משלב 2.9) עם media.
בסרום מופחת
הערה: נפח חומר הזרעים ישתנה בהתאם לניסוי הבודד. בעת בחירת נפח זרעים, לקחת בחשבון: שפע של זרעים במדגם רעילות פוטנציאלית. הומוגנטים גולמיים יכולים להיות רעילים לתאים. לכן, השתמש בעוצמת הקול הנמוכה ביותר האפשרית כדי לפקח על האפקט הרצוי. נפחים שנבדקו בעבר של ליזט/באר נעים בין 1-5 מיקרוליטר, המקבילים ל-5-20 מיקרוגרם חלבון כולל. ודא כי נפח הכולל לכל באר (זרעים + מדיה בסרום מופחת) הוא 10 μl.
- ערבבו את התכולה משני הצינורות המתוארים ב-4.1 וב-4.2, החליקו בעדינות כדי לערבב, סובבו לזמן קצר כלפי מטה (1,000 x גרם, 5 שניות) ודגרו ב-RT במשך 20 דקות לפחות ועד שעתיים.
- פיפטה עדינה 20 μl של קומפלקס התמרה בצד של בארות biosensor בודד. השתמש בשלושה עותקים טכניים, במידת האפשר. להחזיר תאים מטופלים לאינקובטור למשך 24-48 שעות. דגירה באותם תנאים כמתואר בשלב 3.6.
הערה: תנאי הבקרה השלילי המתאים למערך זה הוא תאי ביוסנסור המטופלים בליפוזומים ריקים (כלומר, מגיב ליפוזומים + מדיה מופחתת בסרום) מכיוון שיישום פוספוליפידים מציג שינוי קל בפרופיל הפלואורסצנטי ביחס לתאי ביוסנסור שאינם נחשפים למגיב ליפוזום.
5. קצירת תאים עבור ציטומטריה של זרימת FRET
הערה: לפני קצירת תאים – בדרך כלל 24-48 שעות לאחר הטיפול – ניתן לקבל קריאה ראשונית של פעילות הזריעה באמצעות מסנן חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך סטנדרטי. תאים שטופלו ללא חומר זרע (כלומר, ליפוזומים ריקים) יראו פלואורסצנטיות מפוזרת, בעוד שתאים שטופלו בחומר זרעים יראו ניקוב אינטנסיבי ותכלילים תוך-תאיים ברשתית (איור 1A-B).
- באמצעות צינור רב ערוצי, לשאוף את כל התווך התא (150 μl) . טריפסיניזציה (50 μl) תאים במשך 5 דקות, ומרווה עם 150 μl מדיום תרבית מקורר. אין לכלול שטיפת PBS לפני טריפסיניזציה בשלב זה, מכיוון שהיא עלולה לגרום להרמת תאים ולאובדן תאים לאחר מכן. אין לכלול תאים מתים מזהמים ופסולת במהלך ציטומטריית זרימה באמצעות אסטרטגיות gating.
- מיד לאחר המרווה מעבירים תאים לצלחת תחתונה עגולה היטב 96, וצנטריפוגה ב 1,000 x גרם למשך 5 דקות ב- RT.
- יש לשאוף ולהשליך את המדיום, תוך הקפדה שלא להפריע לכדורית התא.
- בעדינות, אך ביסודיות, יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-50 μl 2% paraformaldehyde, ולדגור במשך 10 דקות. לחלופין, הפעל תאים חיים, אם כי קיבוע מספק תוצאות נקיות ועקביות יותר.
- תאי צנטריפוגות ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוף ולהשליך paraformaldehyde, בזהירות כדי למנוע הפרעה כדור התא.
- בעדינות, אך ביסודיות, השהה מחדש את גלולת התא במאגר ציטומטריה של זרימה מקוררת של 200 μl (תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS), 1% FBS, 1 mM EDTA) והפעל את הצלחת בהקדם האפשרי כדי למנוע התגבשות תאים.
6. ציטומטריית זרימת FRET
הערה: השתמש בציטומטר זרימה כגון MACSQuant VYB, המצויד בקווי לייזר ובערכות מסננים תואמי FRET (טבלה 2). עבור כל שלב בחלק זה, לחץ על הבאר המעניינת באמצעות תבנית הקידוח 96 של התוכנה, ולחץ על "הפעל" כדי להתחיל בקליטת הדגימה ובזרימה. צור תרשימים או טבלאות סטטיסטיקה על ידי לחיצה על סמל 'חלון ניתוח חדש'. שנה פרמטרים של ציר בתרשים דו-משתני בודד על-ידי לחיצה על הכותרת בציר X או Y ובחירת המסנן המתאים. כדי להזיז אוכלוסיות תאים או אותות פלואורסצנטיים, הגדל או הקטן את המתחים הקשורים למסננים המתאימים. באמצעות מכשיר זה, הפעל <1,000 אירועים לשנייה כדי להבטיח ניטור מדויק של תא יחיד.
- צור תרשים דו-משתני של אזור פיזור צדדי (SSC-A) לעומת אזור פיזור קדמי (FSC-A), וכאשר קו התא #1 פועל, התאם את מתחי SSC ו- FSC עד שאוכלוסיית התא תהיה ברביע השמאלי התחתון. לחצו על הכלי מצולע והגדירו את אוכלוסיית התאים (שער P1). עבור כל הפרמטרים gating ראה איור 2.
- צור תרשים דו-משתני FSC-H לעומת FSC-A, והחל את שער P1 על חלקה זו על-ידי לחיצה על "חי" מעל העלילה ובחירה באפשרות P1. כאשר קו התא #1 פועל, לחץ על הכלי מצולע והגדר תאים בודדים (שער P2).
- צור 3 חלקות היסטוגרמה, אחת לכל אחד מהמסננים המעניינים: CFP, YFP ו- FRET. החל את שער P2 על כל החלקות הללו על ידי לחיצה על "חי" מעל החלקות ובחירה ב- P2. כאשר קו התא #1 פועל, התאם את המתחים כך שאוכלוסיית התאים החציונית בהיסטוגרמות CFP, YFP ו- FRET תהיה בין 0 ל- 1. כדי למדוד CFP ו-FRET, עורר תאים באמצעות לייזר של 405 ננומטר, ולכוד פלואורסצנטיות באמצעות מסנן 450/50 ננומטר ומסנן 525/50 ננומטר, בהתאמה. כדי למדוד YFP, לעורר תאים עם לייזר 488 ננומטר וללכוד פלואורסצנטיות עם מסנן 525/50 ננומטר. הגדרות לייזר וסינון מתוארות בהרחבה בטבלה 2.
- בצע פיצוי עבור זליגת CFP לערוצי FRET ו- YFP.
הערה: פיצוי הוא תהליך של תיקון זליגה פלואורסצנטית. זליגת פלואורסצנטיות מתרחשת בכל פעם שפליטת פלואורסצנטיות של פלואורוכרום אחד מזוהה בתוך מסנן שנועד למדוד אות מפלואואורוכרום אחר. עם פיצוי מתאים, ניתן להסיר את פלואורסצנטיות הזליגה של CFP מערוצי FRET ו- YFP.
הערה: פיצוי דורש נוכחות של תאים פלואורסצנטיים -חיוביים ושליליים. לכן, כדי לפצות על תאים חיוביים CFP (קו תא #2), תאים שליליים (קו תא #1) יש להוסיף למדגם לפני הריצה.
- ספייק פנימה 30 μl של קו תא #1 השעיה מבאר אחת לתוך 200 μl של קו התא #2 השעיה מיד לפני פיצוי.
- לחץ על הסמל "הגדרות מכשיר", ולאחר מכן על הכרטיסייה 'פיצוי', וסמן את 'מטריצה' כדי לפתוח את טבלת הפיצויים.
- צור התוויית FRET-A לעומת CFP-A דו-משתנית, והחל שער P2, כמתואר בשלב 6.3. כאשר קווי התא 1+2 פועלים, לחץ על סמל 'רביע' וצייר רבעים כך שהאוכלוסיות הפלואורסצנטיות -שליליות והחיוביות יופרדו על ידי שני הרבעים התחתונים (שערים LL3 ו- LR3, בהתאמה).
- צור טבלת סטטיסטיקה המציגה את עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI) של FRET עבור שערי LL3 ו- LR3. התאם את הפרמטר FRET במטריצת הפיצוי עד שה- MFI של אות FRET יהיה שווה ערך בין LL3 ו- LR3. לאחר שלב זה, ה- MFI של אות FRET שווה בין תאים לא מוכתמים לתאים חיוביים ל- CFP, מה שמרמז על היעדר זליגת CFP לערוץ FET.
- צור תרשים דו-משתני YFP-A לעומת CFP-A והחל את שער P2, כמתואר בשלב 6.3. צייר רבעים (LL4 ו- LR4) בדומה לזה שנעשה בשלב 6.4.3.
- צור טבלת סטטיסטיקה המציגה את ה- MFI של YFP עבור LL4 ו- LR4. התאם את הפרמטר YFP במטריצת הפיצוי עד שה- MFI של אות YFP יהיה שווה ערך בין LL4 ו- LR4. לאחר שלב זה, ה-MFI של אות YFP שווה בין תאים לא מוכתמים לתאים חיוביים ל-CFP, מה שמרמז על היעדר זליגת CFP לערוץ YFP.
- לאחר הגדרת השער והפיצוי, הדגישו בארות מעניינות והריצו את שארית הצלחת.
- לאחר הפעלת כל הדגימות, יצא קבצי נתונים על ידי לחיצה על 'קובץ' ולאחר מכן על 'העתק'. בחר בכרטיסייה 'קובצי נתונים', סמן את תיקיית הניסוי ולחץ על 'העתק'.
