טכניקה להערכת ההשפעה המעכבת של חשיפה לרעלנים על זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים זעירים (mEPSCs)

תקציר

מקור: Hubbard, K. et. al., הערכה תפקודית של נוירוטוקסינים ביולוגיים בתרביות מרושתות של נוירונים במערכת העצבים המרכזית שמקורם בתאי גזע.J. Vis. Exp. (2015)

הסרטון מדגים את הניתוח האלקטרופיזיולוגי של נוירונים שמקורם בתאי גזע עובריים לאחר חשיפה לרעלנים עצביים. טיפול נוירונים אלה עם נוירוטוקסינים בוטולינום מפחית את התדירות של זרמים מעוררים מיניאטוריים ספונטניים לאחר סינפטי, המאשר עיכוב של שידור סינפטי

.

פרוטוקול

1. התאמה של תאי גזע עובריים (ESC) לתרבית תרחיף ללא תאי הזנה

1. הפשירו תאי גזע עובריים בטמפרטורה של 37°C עד שיישאר רסיס קרח.
2. בעזרת צינור P1000, העבירו בעדינות 1 - 2.5 x 10⁶ תאי גזע עובריים מנותקים לצלחת שאינה מטופלת בתרבית רקמה המכילה 10 מ"ל של תווך ESC שחומם מראש. יש לדגור באינקובטור תרביות רקמה לחות למשך 20 שעות בטמפרטורה של 37°C ו-5% פחמן דו-חמצני (CO₂).
3. לאחר 20 שעות, לשטוף תאים על ידי העברה עדינה של תרבית התרחיף לצינור חרוטי 15 מ"ל באמצעות פיפט סרולוגי 10 מ"ל. גלולות ESC במשך 3 דקות ב 200 x גרם. במהלך הסחיטה, מוסיפים 10 מ"ל של צלחת ESC טרייה בינונית עד בעלת הדבקה נמוכה.
4. שואפים סופרנטנט, מקפידים להימנע מעקירת כדורית התא, ומוסיפים 1 מ"ל מדיום ESC טרי לכדורית התא. מעבירים תאים לצלוחית החיידקים באמצעות פיפט P1000 וחוזרים לאינקובטור.
5. התבונן בתאים מדי יום עד שהאגרגטים הופכים גלויים לעין בלתי (בדרך כלל 4 - 8 ימים (d); הצברים יהיו 0.2 - 0.5 מ"מ). אם הצברים אינם נראים לעין לאחר 4 ד', חזור על שלב 1.3. ברגע שהצברים גלויים, נתק ותחזק ESCs כמתואר בסעיף 2.

2. העברת ESC ותחזוקה

1. מעבירים אגרגטים ESC לצינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות פיפט סטרילי של 10 מ"ל ומאפשרים לאגרגטים לשקוע לכדורייה קומפקטית (בדרך כלל 3 - 5 דקות). יש לשאוף את הסופרנטנט, להיזהר מהפרעה לכדורית התא, ולשטוף אגרגטים במי מלח חוצצי פוספט (PBS) במינון 5 מ"ל. למרות שקיעת כוח הכבידה מומלצת, לחלופין, תאי גלולה ב 100 x גרם במשך 2.5 דקות במקום לחסוך זמן.
2. שאפו PBS והוסיפו 500 מיקרוליטר טריפסין. יש לדגור על אגרגטים בטריפסין במשך 3 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 37°C. להוסיף 500 μl ESC בינוני כדי לדלל את הטריפסין ולשבש בעדינות 10 פעמים עם צינור P1000 כדי לפרק אגרגטים. ספירת תאים באמצעות המוציטומטר.
3. גלולה תאים מנותקים במשך 3 דקות ב 200 x g ו resuspend תאים לריכוז סופי של 1.0 x 10⁷ תאים / ml בתווך ESC. מעבירים 150 μl (1.5 x 10^{6 תאים}) ל-10 מ"ל של תווך ESC טרי בצלחת חיידקים בקוטר 10 ס"מ וחוזרים לאינקובטור תרביות רקמה למשך 48 שעות. ניתן להתמיין בין תאי גזע עובריים עודפים, לשמור בהקפאה במינון של 1 - 5 x 10⁶ תאים/מ"ל ב-90% ESC בינוני בתוספת 10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO), או להשליך.
4. אגרגטים למעבר כל 48 שעות. אגרגטים מוכנים למעבר ייראו בבירור, בקטרים העולים על 0.5 מ"מ.
   הערה: הפשרה ותרבית של תאים מותאמים להקפאה מתבצעים לפי שלבים 1.2 - 1.4. אגרגטים יהיו מוכנים למעבר תוך 48 - 72 שעות.

3. דיפרנציאציה עצבית

הערה: בצע שלבים 3.1 - 3.5 לפני הצהריים ושלב 3.7 אחרי הצהריים. סקירה כללית של הליכי הבידול מוצגת באיור 1A.

1. נתק ESCs כמו בשלבים 2.1 - 2.5. מעבירים 350 μl (3.5 x 10⁶) של תאי גזע עובריים מנותקים לצלחת בעלת חיבור נמוך בקוטר 10 ס"מ המכילה מדיום בידול של 25 מ"ל. מניחים על שייקר מסלול מוגדר 30 - 45 סל"ד בתוך אינקובטור תרבית רקמות ב 37 ° C עם 5% CO₂. זהו היום הראשון של ההבחנה, המכונה יום במבחנה (DIV) -8.
   הערה: שימוש בכלי חיבור נמוך במיוחד מייקר את עלות השיטה אך מניב יבולים מעט גדולים יותר מצלחות פטרי חיידקיות מכיוון שאגרגטים יכולים להיצמד מדי פעם לצלחות פטרי. ניתן לשנות את קנה המידה של נפחים בינוניים ומספרי תאים בהתאם אם מעדיפים גדלים שונים של מנות.
2. לאחר 48 שעות (DIV -6), השתמש בפיפט של 25 מ"ל כדי להעביר את צברי התאים המתמיינים לצינור חרוטי של 50 מ"ל. מיד להוסיף 25 מ"ל טרי של מדיום בידול צלחת פטרי.
3. אפשר לאגרגטים לשקוע במשך 2 - 5 דקות, ולייצר גלולה גלויה בעומק 1 - 2 מ"מ. התעלם מתאים בודדים או מצברים קטנים שנותרו בהשעיה. שאפו בזהירות את התווך והעבירו את גלולת התא חזרה לצלחת הפטרי באמצעות P1000. מניחים על שייקר סיבובי באינקובטור תרבית רקמות.
4. ב- DIV -4, חזור על שלב 3.2. הגלולה תהיה בעומק 2 - 4 מ"מ. החלף 30 מ"ל מדיום התמיינות בתוספת 6 מיקרומטר חומצה רטינואית all-trans (RA) לצלחת פטרי. חזרו לשייקר הסיבובי באינקובטור תרביות הרקמה למשך 48 שעות נוספות.
5. ב- DIV -2, חזור על שלב 3.3. הגלולה תהיה בעומק 4 - 8 מ"מ בשלב זה.
6. ב- DIV -1, הכינו משטחי ציפוי כמו בסעיף 4.
7. ב DIV 0, להפשיר 5 מ"ל של תאי אב עצביים pre-aliquoted וקפואה (NPC) tripsinization בינוני ב 37 ° C במשך 5 - 10 דקות ומניחים במכסה מנוע תרבית רקמה. באמצעות פיפט 25 מ"ל, להעביר אגרגטים מבדילים לצינור חרוטי 50 מ"ל. אפשרו לאגרגטים להתיישב ושאפו בזהירות את המדיום. שטפו את הגלולה פעמיים עם PBS של 10 מ"ל, ואפשרו לצברים לשקוע בין השטיפות.
8. לאחר שטיפת PBS השנייה, להוסיף 5 מ"ל של מדיום טריפסיניזציה NPC לגלולה ולדגור ב 37 ° C במשך 5 דקות. בעדינות להעיף את הצינור לאחר 2.5 דקות.
9. יש להוסיף 5 מ"ל של מעכב טריפסין 0.1% פולי סויה (STI) כדי להשבית טריפסין ולערבב על-ידי היפוך. בעדינות triturate 10 - 15 פעמים עם צינור סרולוגי 10 מ"ל עד תרחיף תאים הומוגני יחסית מיוצר.
10. העבירו באיטיות את מתלה התא למסננת תאים של 40 מיקרומטר או 70 מיקרומטר המונחת על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל. לאחר שכל התרחיף סונן, הוסף 1 מ"ל של מדיום N2 כדי לשטוף את התאים הנותרים דרך המסנן וגלול את תרחיף התא המנותק למשך 6 דקות ב 200 x גרם.
11. יש לשאוף מדיום מבלי להפריע לכדור. יש לשטוף תאים פעמיים עם 10 מ"ל N2 בינוני, תאי גלולה במשך 5 דקות ב 200 x גרם, ו triturate בין כביסה עם P1000. לפני השטיפה השנייה, לספור תאים באמצעות hemocytometer.
12. תאי השעיה בתווך N2 ב 1 x 10⁷ תאים למ"ל ופלטת תאי גזע עובריים שמקורם בתאי גזע (ESNs) בצפיפות תאים של 150,000 - 200,000 תאים לסמ"ק².
13. העבר ESN מצופים חדשים לאינקובטור תרבית רקמות לחות ב 37 ° C ו 5% CO₂ ולשמור כמו בסעיף 5.

4. הכנת משטחי תרבית לציפוי מבשרי עצבים ב- DIV 0

1. הכינו מנות שטופלו בתרבית רקמות לפחות יום אחד לפני הציפוי. הוסף כמות מספקת של פוליאתילניאמין (PEI; 25 מיקרוגרם/מ"ל ב-H₂O סטרילי) או פולי-D-ליזין (PDL; 100 מיקרוגרם/מ"ל ב-H₂O סטרילי) כדי לכסות צלחות פלסטיק שטופלו בתרבית רקמות ולדגור על O/N ב-37°C.
2. בבוקר הציפוי, שטפו כלים פעמיים עם H₂O מזוקק כפול ופעם אחת עם PBS. לאחר השטיפה הסופית, מוסיפים מספיק N2 בינוני כדי לכסות את התבשיל (למשל, 1 מ"ל לכל באר של צלחת 12 באר או 4 מ"ל לכל צלחת 6 ס"מ).
3. הכינו כיסויי זכוכית בקוטר 18 מ"מ לפחות יום אחד לפני ציפוי תא העצב. יש לנקות את החלקות על ידי ניקוי פלזמה למשך 4 דקות.
4. העבירו מיד כיסויים מנוקים לפרפילם שטוף אתנול בתחתית צלחת סטרילית גדולה והוסיפו 400 מיקרוליטר של תמיסת PEI או PDL, שהוכנה כמו בשלב 4.1. יש לדגור לילה (O/N) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לתרביות רקמות.
5. בבוקר, יש לשטוף את החלקות שלוש פעמים במים ולהוסיף 5 מיקרוגרם/מ"ל למינין ב-PBS למשך שעה עד 3 שעות ב-37°C. לפני ניתוק נוירונים, שואפים את הלמינין ומיד להעביר את הכיסוי לבאר של צלחת 12 באר המכילה 1 מ"ל של מדיום NPC, להיות בטוח לשמור על הצד המטופל פונה כלפי מעלה.
6. אחסנו את הכלים והכיסויים בטמפרטורה של 37°C עד שה-NPCs יהיו מוכנים לצלחת.

5. תחזוקה של נוירונים

1. ב DIV 1, לשאוף מדיום ולהחליף עם מדיום תרבות N2.
2. ב DIV 2 ו 4, לשאוף מדיום ולהחליף עם מדיום תרבית B27.
3. ב-DIV 8, יש לשאוף מדיום ולהחליף במדיום תרבית B27 המכיל מעכבי מיטוטי לסילוק תאים לא עצביים מזהמים.
4. ב- DIV 12, החלף במדיום תרבית B27.
5. אל תסיר ESN מסוג DIV 12⁺ מ-5% CO₂ עד להכנה.

6. עיכוב מדוד של שידור סינפטי (MIST) בדיקה לכימות זרמים מעוררים פוסט-סינפטיים זעירים

זהירות: נוירוטוקסינים קלוסטרידיאליים הם החומרים הרעילים ביותר הידועים, עם ערכי LD₅₀ אנושיים מוערכים נמוכים כמו 0.1 - 1 ננוגרם/ק"ג. קבל את האישורים הדרושים לפני השימוש ברעלים אלה והשתמש באמצעי זהירות מתאימים.

1. מדללים בזהירות את BoNT/A ל-100x, הריכוז הסופי הרצוי בתווך תרבית ESN, ומחממים ל-37ºC. מוסיפים את נפח הרעלן המתאים לתרביות DIV 21+ ESN, מערבלים את צלחת התרבית וחוזרים לאינקובטור.
2. אם התאים ינותחו יותר מ -4 שעות לאחר שיכרון, להוסיף רעלן לצלחת ולהסתחרר מבלי להסיר מ 5% CO₂, כגון ישירות באינקובטור או בתא CO₂ קבוע.
3. בנקודת הזמן המתאימה, שאפו את מדיום תרבית ESN ושטפו פעמיים עם מאגר הקלטה חוץ-תאי (ERB). הוסף 4 מ"ל של ERB בתוספת 5.0 מיקרומטר tetrodotoxin ו 10 μM bicuculline, חסימת פוטנציאלי פעולה אנטגוניזם פעילות קולטן GABA_A, בהתאמה.
4. מעבירים את המנה למתקן האלקטרופיזיולוגיה. לא זילוח ולא בקרת טמפרטורה נדרשים עבור בדיקת MIST.
5. משוך זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך מיקרופיפטה כדי לייצר פיפטת הקלטה עם התנגדות של 5-10 mΩ ומלא במאגר הקלטה תוך תאי. טבלו בעדינות פיפטת הקלטה ממולאת בריאגנט סיליקון לפני ההקלטה.
6. באמצעות מזרק מלא אוויר, לספק לחץ חיובי כמו פיפטה הקלטה הוא הוריד לתוך ERB. לאחר נחיתה עדינה של פיפטת ההקלטה על הסומה של תא העצב כדי להיות מוקלט, להסיר לחץ חיובי וליצור gigaseal. הפחת את מתח האחיזה ל -70 mV. הפעילו בזהירות לחץ שלילי כדי לפרוץ לתצורת התא כולו.
7. עבור למהדק הנוכחי כדי לפקח ולהקליט פוטנציאל קרום מנוחה. ללא התאמה לפוטנציאלי צומת נוזליים, פוטנציאל קרום המנוחה יהיה בין -67 ל -82 mV.
8. בצע הקלטה רציפה של מהדק מתח -70 mV למשך 4 - 5 דקות כדי לזהות זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים זעירים (mEPSC).
9. נתח 4 דקות של נתונים מוקלטים לזיהוי mEPSC באמצעות תוכנה לזיהוי ספייקים עם ההגדרות הבאות: סף, 5; תקופה לחיפוש מקומי מרבי, 10,000 מיקרו-שניות; זמן לפני שיא נקודת ההתחלה, 5,000 מיקרו-שניות; תקופה לחיפוש זמן ריקבון, 20,000 מיקרו-שניות; שבריר שיא כדי למצוא זמן דעיכה, 0.37; תקופה לממוצע קו בסיס, 1,000 מיקרו-שניות; סף שטח, 20; מספר נקודות לשיא ממוצע, 1; כיוון השיא, שלילי.
10. אסוף ושמור מידע על אירועים שזוהו. חלק את מספר האירועים שזוהו ב- 4 דקות ב- 240 כדי לקבוע את תדר mEPSC ב- Hz.
11. אסוף תדרי mEPSC עבור 8 - 12 פקדים ו- 8 - 12 דגימות שטופלו ב- BoNT עבור כל תנאי חשיפה. נתח תדירות מול בקרות תואמות גיל והרבה. לקבוע את המובהקות הסטטיסטית של % עיכוב של פעילות סינפטית באמצעות ANOVA חד-כיווני ומבחן פוסט-הוק של דנט.

תוצאות

איור 1. ESN מותאמי מתלים נשארים יציבים מבחינה מיטוטית ומבטאים סמנים של פלוריפוטנציה.(A) סכמה של תחזוקה ובידול של ESC. נוכחות או היעדר חומצה רטינואית (RA) או גורם מעכב לוקמיה (LIF) מסומן על ידי + או –. ניתנת השוואה בין ימים במבחנה (DIV) לבין שלבי התפתחות קלאסיים (DS) עבור תרביות נוירונים ראשוניות. (B) שיעורי ההתרבות של קווי תאי R1, D3 ו-C57BL/6J ES מתייצבים ב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
טבלה 1. ESC ו-ESN
נוקאאוט DMEM	לייף טכנולוגיות	10829-018	מדיה: מדיום תרבות ESC
			ניסוח והערות: 500 מ"ל
100x MEM NEAA	לייף טכנולוגיות	11140-050	מדיה: יש לאחסן ב-4°C למשך עד חודש
			ניסוח והערות: 6 מ"ל
200 מ"מ ל-אלניל-ל-גלוטמין	ATCC	30-2115	6 מ"ל
FBS מוסמך ES	תאי גזע מיושמים	ASM-5007	90 מ"ל
100x אנטיביוטיקה	סיגמא-אולדריץ'	A5955	3 מ"ל
55 מ"מ 2-מרקפטואתנול	לייף טכנולוגיות	21985-023	1.1 מ"ל
107 יחידות/מ"ל LIF	מיליפור	ESG1107	60 מיקרוליטר
נוקאאוט DMEM	לייף טכנולוגיות	10829-018	מדיה: מדיום בידול ESC
			ניסוח והערות: 436.6 מ"ל
100x MEM NEAA	לייף טכנולוגיות	11140-050	מדיה: יש לאחסן ב-4°C למשך עד חודש
			ניסוח והערות: 5 מ"ל
200 מ"מ ל-אלניל-ל-גלוטמין	ATCC	30-2115	5 מ"ל
סרום מאושר ESC	תאי גזע מיושמים	ASM-5007	50 מ"ל
100x אנטיביוטיקה	סיגמא-אולדריץ'	A5955	2.5 מ"ל
55 מ"מ 2-מרקפטואתנול	לייף טכנולוגיות	21985-023	0.9 מ"ל
PBS של דולבקו	סיגמא-אולדריץ'	D8537	מדיה: מדיום טריפסיניזציה NPC
			ניסוח והערות: 100 מ"ל
0.5 מטר EDTA (18.3%)	סיגמא-אולדריץ'	3690	מדיה: להקפיא ב 5 מ"ל aliquote
			ניסוח והערות: 0.266 מ"ל
טריפסין	סיגמא-אולדריץ'	T8802	50 מ"ג
פוליאתילנימין (PEI)	סיגמא-אולדריץ'	P3143	מדיה: פתרונות ציפוי פני השטח
			ניסוח והערות: 2.5 מיקרוגרם/מ"ל ב-H20
פולי-די-ליזין (PDL)	סיגמא-אולדריץ'	P7280	מדיה: לשימוש בטווח של 1 שבועות
			ניסוח והערות: 100 מיקרוגרם/מ"ל ב-H20
למינין	סיגמא-אולדריץ'	L2020	5 מיקרוגרם/מ"ל ב-H20
DMEM/F12 + GlutaMAX	לייף טכנולוגיות	10565-018	מדיה: מדיום תרבות NPC
			ניסוח והערות: 492.5 מ"ל
100x N2 ויטמינים	לייף טכנולוגיות	17502-048	מדיה: יש לאחסן ב-4°C למשך עד חודש
			ניסוח והערות: 5 מ"ל
100x אנטיביוטיקה	סיגמא-אולדריץ'	A5955	2.5 מ"ל
נוירובזל A	לייף טכנולוגיות	10888-022	מדיה: מדיום תרבות ESN
			ניסוח והערות: 482.5 מ"ל
50x ויטמינים B27	לייף טכנולוגיות	17504-044	מדיה: יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך חודש אחד
			ניסוח והערות: 10 מ"ל
200 מ"מ ל-אלניל-ל-גלוטמין	ATCC	30-2115	5 מ"ל
100x אנטיביוטיקה	סיגמא-אולדריץ'	A5955	2.5 מ"ל
5-פלואורו-2'-דאוקסיורידין (5FDU)	סיגמא-אולדריץ'	F0503	מדיה: 2000x מעכבים מיטוטיים aliquot ולאחסן ב -20 °C
			ניסוח והערות: dd 150 מ"ג 5FDU ו 350 מ"ג אורידין ל 10 מ"ל נוירובזל A. מסנן סטרילי, aliquot ולהקפיא. השתמש ב- 2000x במדיום תרבות ESN.
אורידין	סיגמא-אולדריץ'	U3003
טריפל אקספרס טריפסין	לייף טכנולוגיות	12605-010	מדיה: שונות
			ניסוח והערות: חנות ב- RT
DMSO	סיגמא-אולדריץ'	D8418	store ב- RT
מעכב טריפסין פולי סויה (STI)	סיגמא-אולדריץ'	T6414	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C
אתנול	סיגמא-אולדריץ'	E7023	store ב- RT
חומצה אסקורבית	סיגמא-אולדריץ'	A4403	הכינו ציר של 100 מ"מ על ידי המסת 100 מ"ג חומצה אסקורבית ב-5.7 מ"ל של תערובת 50:50 DMSO/אתנול.
חומצה רטינואית (RA)	סיגמא-אולדריץ'	₪625	השהה 15 מ"ג RA ב 9 מ"ל 50:50 DMSO/אתנול. תוסף עם 1 מ"ל של 100 mM חומצה אסקורבית מלא. Aliquot ומאוחסן ב -80 °C. יציב במשך 6 חודשים.
טבלה 2. ערפל
NaCl	סיגמא-אולדריץ'	71386	מדיה: מאגר הקלטה חוץ-תאי
			ריכוז סופי (mM): 58.44
			MW: 140
KCl	סיגמא-אולדריץ'	60135	מדיה: (ERB; pH = 7.3, 315 mO)
			ריכוז סופי (mM): 74.56
			MW: 3.5
NaH2PO4	סיגמא-אולדריץ'	S3139	מדיה: יציב ב-4°C למשך 6 חודשים לפחות.
			ריכוז סופי (mM): 119.98
			MW: 1.25
CaCl2	סיגמא-אולדריץ'	21115	ריכוז סופי (mM): 110.98
			MW: 2
MgCl2	סיגמא-אולדריץ'	63069	ריכוז סופי (mM): 95.21
			MW: 1
D-גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G8644	ריכוז סופי (mM): 180.16
			MW: 10
HEPES	סיגמא-אולדריץ'	H0887	ריכוז סופי (mM): 238.3
			MW: 10
קיי-גלוקונאט	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 1847	מדיה: מאגר הקלטה תוך תאי
			ריכוז סופי (mM): 234.5
			MW: 140
NaCl	סיגמא-אולדריץ'	71386	מדיה: (IRB; pH = 7.3, 320 mO)
			ריכוז סופי (mM): 58.44
			MW: 5
MG-ATP	סיגמא-אולדריץ'	A9187	מדיה: יציב ב-4°C למשך 6 חודשים לפחות.
			ריכוז סופי (mM): 507.18
			MW: 2
Li-GTP	סיגמא-אולדריץ'	G5884	ריכוז סופי (mM): 523.18
			MW: 0.5
CaCl2	סיגמא-אולדריץ'	21115	מדיה: יציב ב-4°C למשך 6 חודשים לפחות.
			ריכוז סופי (mM): 110.98
			MW: 0.1
MgCl2	סיגמא-אולדריץ'	63069	מדיה: יציב ב-4°C למשך 6 חודשים לפחות.
			ריכוז סופי (mM): 95.21
			MW: 1
EGTA	סיגמא-אולדריץ'	E3889	380.35 מדיה: יציב ב-4°C למשך 6 חודשים לפחות mo. ריכוז סופי (mM): 380.35 MW: 1
HEPES	סיגמא-אולדריץ'	H0887	מדיה: יציב ב-4°C למשך 6 חודשים לפחות.
			ריכוז סופי (mM): 238.3
			MW: 10
ביקוקולין	טוקריס	131	מדיה: שונות
			ריכוז סופי (mM): 0.01
			MW: 417.85
CNQX	סיגמא-אולדריץ'	C239	ריכוז סופי (mM): 0.01
			MW: 276.12
טטרודוטוקסין	סיגמא-אולדריץ'	A8001	ריכוז סופי (mM): 0.005
			MW: 645.74
BoNT/A-/G	מטביולוגיה	לא ישים	מדיה:
			ריכוז סופי (mM): TBD
			MW: 150,000
רעלן טטנוס	סיגמא-אולדריץ'	T3194	ריכוז סופי (mM): TBD
			MW: 150,000
סיגמקוט	סיגמא-אולדריץ'	SL-2	ריכוז סופי (mM): N/A
			MW: N/A
טבלה 3. ציוד ותוכנה
MiniAnalysis (גרסה 6.0.7)	Synaptosoft, Inc.	לא ישים	תוכנה לזיהוי אירועים
איגור פרו (גרסה 6.22A)	WaveMetrics	לא ישים	תוכנה להדמיה של הקלטות
פאצ'מאסטר	הקה	לא ישים	תוכנה לרכישת נתונים
אולימפוס IX51 מיקרוסקופ הפוך	אולימפוס	לא ישים
מיקרומניפולטור	סאטר אינסטרומנט	MPC-365
מגבר מהדק טלאי	הקה	ECB10USB
מושך מיקרופיפטה	סאטר אינסטרומנט	P-1000
צינורות נימים Borosilicate	סאטר אינסטרומנט	B150-86-10	קורנינג 7740
כיסויי זכוכית 18 מ"מ	פישר	12-545-84
מנקה פלזמה	האריק פלזמה	PDC-32G
מסננת תאים (40 מיקרומטר)	פישר	08-771-1
סטובל רקדנית בטן שייקר	פישר	15-453-211
כלים עם הדבקה נמוכה	פישר	05-539-101	קורנינג 3262
מנות בקטריאליות	VWR	25384-302	100 x 15 מ"מ