ייצור וטיהור נוגדנים רקומביננטיים מתאי יונקים

תקציר

מקור: Shivange, Gururaj, et al. ניתוח התפלגות הגידול והרקמות של נוגדן טיפולי ספציפי לאנטיגן מטרה. J. Vis. Exp.(2020).

הסרטון מסביר את תהליך ייצור הנוגדנים בתאי המאכסן של יונקים, משלב ביטוי הגנים ועד להפרשה. זה כרוך בתמלול, תרגום, זיהוי אותות, קיפול נכון, ובסופו של דבר שחרור לתוך התווך החוץ תאי באמצעות שלפוחיות הפרשה.

פרוטוקול

1. ביטוי וטיהור נוגדנים

1. תחזוקת תאי CHO
   1. לגדל תאי CHO ב-FreeStyle CHO Media בתוספת תוסף גלוטמין 1x זמין מסחרית ב-37°C תוך ניעור ב-130 סל"ד עם 5% CO₂ באמצעות צלוחיות Erlenmeyer delong, זכוכית או חד פעמיות.
      הערה: מומלץ מאוד להשתמש בבקבוק מבולבל עם פקק מאוורר להגברת התסיסה ולשיפור העברת הגזים בתנאי רעידה. תפוקת נוגדנים מופחתת משמעותית הושגה עם צלוחיות רגילות (לא מבולבלות) עקב תסיסה מוגבלת של תרבית התרחיף.
   2. שמור על מספר התא בין 1-5 x 10⁶ תאים/מ"ל עם >95% כדאיות התא. אם מספר התא גדל מעל 5 x 10⁶ תאים/מ"ל, פצל את התאים. לעולם אל תאפשר לתאי CHO להגיע מתחת ל 0.2 x 10⁶ תאים / מ"ל.
2. טרנספקציה של תאי CHO
   1. לגדל תאי CHO ב 200 מ"ל של מדיה (2 x 10⁶ תאים / מ"ל) ב צלוחיות מבולבלות Erlenmeyer.
      הערה: תרביות תרחיף שגדלו בצלוחיות מבולבלות תמיד הניבו תפוקת חלבון גבוהה יותר בהשוואה לגידול בצלוחיות לא מבולבלות.
   2. בשפופרת של 15 מ"ל, קח 5 מ"ל של מדיה בסגנון חופשי CHO והוסף 50 מיקרוגרם של DNA משובט VH ו- 75 מיקרוגרם של DNA משובט VL. מערבולת לערבב היטב.
   3. לדגור על תערובת הדנ"א בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות
      הערה: דגירה ארוכה יותר מפחיתה את תפוקת החלבון.
   4. הוסף 750 μL של 1 מ"ג / מ"ל פוליאתילנימין (PEI) מלאי לתמיסת ה- DNA ומערבל באגרסיביות את התערובת במשך 30 שניות. לדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות נוספות < br / > הערה: PEI חייב להיות טרי. מחזור הפשרה בהקפאה מרובה של PEI מפחית את התשואה הכוללת באופן משמעותי.
   5. הוסף את כל תערובת ה- DNA וה- PEI לתאים תוך ניעור ידני של הצלוחית. מיד לדגור את צלוחיות ארלנמאייר מבולבל עם תאים ב 37 ° C רועד ב 130 סל"ד.
3. Expression
   הערה: לנוגדן יש פפטיד אות הפרשה המהונדס לקצה N-terminal שלו, המסייע לנוגדנים להיות מופרשים החוצה לתקשורת.
   1. לגדל את התאים הנגועים ב 37 ° C, עם רעד ב 130 סל"ד ביום 1.
   2. ביום השני, יש להוסיף 2 מ"ל של 100x חומר נוגד גושים ו-2 מ"ל של 100x תמיסה אנטי-בקטריאלית-אנטי-מיקוטית. מעבירים את הבקבוק לטמפרטורה נמוכה יותר (32-34 מעלות צלזיוס), עם רעד ב-130 סל"ד.
   3. בכל יום חמישי, הוסף 10 מ"ל של הזנת טריפטון N1 ו -2 מ"ל של תוסף גלוטמין 100x.
   4. המשך לספור את התאים כל יום שלישי באמצעות hemocytometer לאחר צביעת aliquot של תאים עם כתם כחול trypan. ודא שיכולת הקיום של התא נשארת מעל 80%.
   5. ביום 10 או 11, קצרו את המדיום לטיהור נוגדנים. סובב את התרבית במהירות של 3000 x גרם, 4 ° C למשך 40-60 דקות ולאחר מכן סנן את המדיה השקופה באמצעות מסנני בקבוקים של 0.22 מיקרומטר.
4. טיהור
   הערה: טיהור נוגדנים מתבצע באמצעות עמודת Protein-A זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים), באמצעות משאבה פריסטלטית.
   1. אזן את העמודה עם נפח של שתי עמודות של מאגר קשירה (20 mM נתרן פוספט ב- pH 7.4).
   2. מעבירים את המדיה המסוננת המכילה נוגדן (המתקבל בשלב 1.3.5) דרך העמודה בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה.
   3. שטף את העמודה בנפח של שתי עמודות של מאגר כריכה.
   4. יש להצמיד את הנוגדן לשברים של 500 מיקרוליטר באמצעות מאגר אלוציה של 5 מ"ל (30 מ"מ נתרן אצטט ב-pH 3.4).
   5. נטרול ה- pH של הנוגדן המדולל על ידי הוספת 10 μL של חיץ נטרול (3 M נתרן אצטט ב- pH 9) לכל שבר.
      הערה: מספרי שברים 3-6 מכילים את רוב הנוגדנים. מומלץ לשמור את כל השברים במקרה שהנוגדן מדולל בשבר מאוחר מהצפוי.
   6. מדוד את ריכוז הנוגדנים המטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטר על ידי בחירת פרוטוקול ברירת המחדל עבור IgG. הריכוז הסופי של הנוגדן מתקבל במ"ג/מ"ל על ידי התחשבות במשקל המולקולרי ובמקדם הספיגה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדיית פריסטייל CHO	Gibco Life Technologies	חתול # 12651-014
אנטי-אנטי (100X)	Gibco Life Technologies	חתול # 15240-062
חומר נוגד גושים	Gibco Life Technologies	חתול # 01-0057DG
מזרק אינסולין BD	BD BioSciences	חתול #329420
ספקטרום Caliper IVIS	פרקיןאלמר	חתול #124262
תקליטור CHO EfficientFeed B	Gibco Life Technologies	חתול #A10240-01
קורנינג 500 מ"ל DMEM (מדיום הנשר המעובד של דולבקו)	קורנינג	חתול # 10-13-CV
קורנינג 500 מ"ל סל"ד 1640	קורנינג	חתול # 10-040-CV
Cy5 מצומד IgG אנטי-אנושי (H+L)	ג'קסון מחקר חיסוני	חתול # 709-175-149
GlutaMax-I (פי 100)	Gibco Life Technologies	חתול # 35050-061
ערכת HiPure Plasmid Maxiprep	Invitrogen	חתול # K21007
HiTrap MabSelect SuRe עמודה	GE שירותי בריאות	חתול # 11-0034-93
איזופלורן, USP (הפרמקופיאה האמריקאית)	קובטרוס	חתול # 11695-6777-2
משחת עיניים סיכה	רענון Lacri-Lube	חתול #4089
מגיב טרנספקציה PEI	תרמו פישר	חתול # BMS1003A
מודלים ניסיוניים: קווי תאים
אנושי: OVCAR-3	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאי	ATCC HTB-161
אנושי: תאי CHO-K	יציב השתנה במעבדה שלנו	ATCC CCL-61
עכבר: 4T1	מתנה חביבה מד"ר צ'יפ לנדן, UVA
עכבר: MC38	מתנה חביבה מד"ר סוזן אוסטרנד-רוזנברג, UMBC	מאומת באמצעות פרופיל STR