מדידת ההפעלה של פונקציות אפקט בתיווך Fc על ידי נוגדנים HA

תקציר

מקור: Bailey, M. J., et al. שיטה להערכת פונקציות השפעה בתיווך Fc המושרות על ידי נוגדנים ספציפיים לשפעת המגלוטינין. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים בדיקה המודדת את ההפעלה בתיווך נוגדנים של פונקציות השפעה של תאי T. הוספת נוגדן חד-שבטי ספציפי לנגיף השפעת המגלוטינין (HA) לתאי יונקים נגועים המבטאים חומצה היאלורונית גורמת להיווצרות קומפלקסים חיסוניים עם חומצה היאלורונית (HA). עם החדרת תאי T מהונדסים המבטאים קולטני Fc וכתב לוציפראז, תאי T מופעלים על ידי קומפלקסים נוגדנים-HA, והפעלה זו מזוהה על ידי הוספת מצע לוציפראז ומדידת הביולומינסנציה המיוצרת.

פרוטוקול

1. ביטוי של וירוס שפעת Hemagglutinin באמצעות transfection

1. צלחת כליות עובריות אנושיות (HEK 293T) תאים בצפיפות של 2 x 10⁴ תאים / באר בתרבית רקמה לבנה מטופלים צלחת 96 באר ולתת לו לשבת במשך 4 שעות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס (עם 5% CO₂).
2. תאים טרנספקטים עם 100 ng של קידוד DNA עבור hemagglutinin נגיפי ו 0.2 μL של מגיב transfection לכל באר בנפח כולל של 50 μL.
   הערה: הן פלסמיד והן מגיב transfectant מדוללים 1x Opti-Minimum Essential Media (MEM) Reduced Serum Medium.
3. לאחר דגירה על צלחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 18 שעות, יש להסיר את אמצעי הטרנספקציה.

2. הערכת ההפעלה בתיווך FcRg/NFAT של פעילות לוציפראז על ידי נוגדנים חד-שבטיים או Sera

1. ראשית, החלף את מצע הגידול של תאים נגועים ב- 25 μL של מדיה לבדיקה (1x RPMI 1640 בתוספת 4% (vol/vol) סרה עוברית נמוכה מסוג IgG עובר).
2. בצלחת נפרדת של 96 בארות, בצע דילול פי ארבעה של הנוגדנים המעניינים החל מ- 30 מיקרוגרם / מ"ל באמצעות מדיית הבדיקה. בצעו דילולים בטריפליקטים, ופריסת לוחות לדוגמה מודגמת באיור 1A. ודא כי בקרה שאינה כוללת נוגדנים (ללא בקרת נוגדנים) ובקרת רקע (מאגר בדיקה בלבד) כלולים.
   הערה: הן עבור 'ללא נוגדן' והן עבור פקדי רקע, הוסף 25 μL של מאגר הבדיקה במקום הנוגדן.
3. העבר 25 μL של נוגדנים מדוללים סדרתית משלב 2.2 לבארות המתאימות על הצלחת של תאים נגועים.
4. צלחת הדגירה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס (עם 5% CO₂) למשך 15 דקות.
5. הוסף 25 μL של תא Jurkat משפיע שונה המתאים המבטא fcgRIV מורין או FcgRIIIa אנושי (75,000 תאים / באר). הנפח הכולל של כל באר צריך להיות 75 μL, והריכוז הסופי ההתחלתי של הנוגדן הוא 10 מיקרוגרם/מ"ל (איור 1B).
   הערה: עבור פקד הרקע, הוסף 25 μL של מאגר assay במקום תאים משפיעים. כדי לבחון פגוציטוזה בתיווך תאים תלויי נוגדנים, ניתן להשתמש בתא Jurkat שונה המבטא את FcgRIIa האנושי.
6. לדגור את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 6 שעות.
7. הפשרה וחיץ מצע לוציפראז חם במים 37°C במשך כשעה לפני השימוש.
   הערה: כדי להפוך את מצע לוציפראז לחיץ, צור מחדש את מצע בדיקת לוציפראז ליופילי במאגר הבדיקה שסופק. ניתן לאחסן את מאגר המצע המשוחזר ב -30 ° C עד -10 ° C למשך עד שישה שבועות.
8. הוסף 75 μL / באר של חיץ מצע luciferase לכל הבארות למעט בקרת הרקע.
9. קרא על לומינומטר.
10. חשב אינדוקציה של קיפול באמצעות המשוואה הבאה: אינדוקציה של קיפול = (ערך מושרה-ערך רקע) / (ללא ערך mAb-ערך רקע).

תוצאות

איור 1: סכמה של פריסת לוחות מדגם והרכב קבוצות הניסוי. (A) הריכוז ההתחלתי של כל דגימת נוגדנים הוא 10 מיקרוגרם/מ"ל ומדולל סדרתית על פני הצלחת (טור 1 עד טור 12) פי 4. כל דגימה נעשית בטריפליקטים. שורה G שמורה לפקד ללא mAb, ושורה H היא הרקע. (B) הנפח הסופי של כל קבוצת ניסוי לפני הוספת מאגר מצע לוציפראז הוא 75 μL. יש לציין כי במדגם ובקבוצות 'ללא mAb' נוספו 25 μL של תאי אפק...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאי HEK 293T	ATCC	CRL-3216	תאי כליה עובריים אנושיים
ליפופקטמין 2000	לייף טכנולוגיות	11668019	מגיב טרנספקציה
1X Opti-MEM סרום מופחת בינוני	תרמופישר סיינטיפיק	51985-034
תרבית רקמה לבנה טופלה בצלחת 96 בארות	קורנינג, בע"מ	3917	צלחות Assay
10X MEM	גיבקו	11430-030
תא Jurkat המבטא murine FcgRIV	פרומגה	M1201	הערכה מספקת תאים, מערכת בדיקת Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI וסרום IgG נמוך
תא Jurkat המבטא FcgRIIIa אנושי	פרומגה	G7010	הערכה מספקת תאים, מערכת בדיקת Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI וסרום IgG נמוך
תא Jurkat המבטא FcgRIIa אנושי	פרומגה	G9901	הערכה מספקת תאים, מערכת בדיקת Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI וסרום IgG נמוך
לומינומטר	ביוטק	קורא Synergy H1 Multi-Mode	קורא לוחיות Luminescence
מערכת בדיקות Bio-Glo Luciferase	פרומגה	G7940	מכיל מאגר בדיקת לוציפראז ומצע בדיקת לוציפראז